【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，涉及基于特异性hrca等温扩增结核分枝杆菌的序列组及应用。
技术介绍
1、结核分枝杆菌是结核病的病原体。早期诊断、及时治疗是有效控制结核病传播蔓延，恢复结核病患者健康的关键。
2、超支化滚环扩增(hrca)是一种新型的体外核酸扩增技术，该技术对温度的要求较低，不需要昂贵精密的温度循环装置，只需要恒定温度下就可以完成，使用hrca技术来进行结核分枝杆菌的检测有利于降低检测操作难度，缩短检测时间，降低检测成本，而且不需要依赖于特定机器，肉眼就可以进行判读。
3、然而，此类分子检测技术受所选插入序列靶标的影响存在假阳性与假阴性的结果，且技术本身也存在非特异性扩增的可能带来假阳性的结果。基于此，提出此专利技术。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌的高特异性的hrca方法，利用该方法对结核分枝杆菌进行检测，所得结果可靠稳定。
2、本专利技术具体采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种基于特异性hrca等温扩增结核分枝杆菌的序列组，所述序列包括loop、mag、lock1、lock2、lock3，引物seal，引物branch1和branch2；
4、所述loop的核苷酸序列如seq id no.1所示，且5’端磷酸化修饰；
5、所述mag的核苷酸序列如seq id no.2所示，且3’端biotin修饰；
6、所述lock1、
7、所述引物seal的核苷酸序列如seq id no.12所示；
8、所述引物branch1和branch2的核苷酸序列分别如seq id no.13-14所示。
9、进一步地，所述序列组还包括识别引物组，所述识别引物组包括block1、block2、block3、key1、key2、key3，所述block1、block2、block3的核苷酸序列分别如seq id no.6-8所示，所述key1、key2、key3的核苷酸序列如seq id no.9-11所示。
10、第二方面，本专利技术还提供了一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒中包括本专利技术第一方面提供的序列组。
11、第三方面，本专利技术还提供了本专利技术第一方面所述的序列组或第二方面所述的试剂盒在检测结核分枝杆菌中的应用。
12、进一步地，所述应用包括以下步骤，
13、（1）将5条引物序列loop、mag、lock1、lock2、lock3退火合成“锁“结构；
14、（2）将所述步骤（1）获得的“锁”结构与分散好的磁珠混合并孵育，将其固定在磁珠上；
15、（3）将待测样品与所述识别引物组混合并孵育；
16、（4）将所述步骤（3）孵育完成后的待测样品与步骤（2）制备好的磁珠引物混合，完成“解锁”，并对loop引物进行磁选分离；
17、（5）加入所述封闭seal引物与连接酶对loop进行封闭；
18、（6）加入所述branch1引物和branch2引物与聚合酶进行hrca反应；
19、（7）加入钙黄绿素对体系进行荧光信号进行读取，判定阳性/阴性信号。
20、进一步地，所述“锁”中的loop引物可以与引发链seal引物结合，在连接酶作用下被封闭成环，触发下游的hrca反应；
21、进一步地，与磁珠混合的所述“锁”的浓度为200nm。
22、进一步地，loop成环后与branch引物共同进行hrca反应。
23、进一步地，所述步骤（1）中所述退火的温度为95℃，时长为10 min，反应后置于4℃环境保存。
24、进一步地，所述步骤（5）中，连接酶为t4 dna连接酶；
25、进一步地，所述步骤（5）中，所述封闭体系为：tris的终浓度为40mm，mg2cl2的终浓度为10mm，dtt的终浓度为10mm， atp的终浓度为1mm，t4 dna连接酶的终浓度为0.5u/μl。
26、进一步地，所述封闭反应在37℃下进行30分钟，后置于65℃环境10分钟灭活连接酶。
27、进一步地，所述步骤（6）中的反应体系为：步骤（6）中的反应体系为：tris-hcl的终浓度为18-22mm，优选为20mm； (nh4)2so4的终浓度为8-12mm，优选为10mm；kcl的终浓度为8-12mm，优选为10mm；mgso4的终浓度为55-65mm，优选为60mm；edta的终浓度为0.08-0.12mm，优选为0.1mm；dtt的终浓度为0.8-1.2mm，优选为1mm；triton x-100的终浓度为0.08％-0.12%，优选为0.1%；甘油的终浓度为1-3％，优选为2%；支链引物对的终浓度为0.08-0.12μm，优选为0.1μm；dntps的终浓度为0.8-1.2mm，优选为1mm；bst dna聚合酶的终浓度为300-350u/μl，优选为320 u/μl。
28、进一步地，所述步骤（6）的反应在60-68℃下进行0.8-1.2小时，优选地，反应在65℃下进行1小时，然后置于75-85℃环境8-12 min灭活聚合酶，优选地，置于80℃环境10min。
29、进一步地，所述步骤（6）中当指示剂为钙黄绿素时，在可见光下，颜色显示淡黄色，表示阳性，颜色显示淡粉色，表示阴性；在紫外光下，颜色显示绿色荧光，表示阳性，颜色显示无荧光，表示阴性。
30、本专利技术采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：
31、（1）本专利技术所提供的序列组分为识别与扩增两个部分。识别部分的引物组根据结核分枝杆菌的插入序列is6110来设计，采用“多对一”的方法来识别目的基因，利用多条引物合成类似“锁”的结构来提高靶标基因识别的特异性，保证了对结核分枝杆菌识别的准确性。扩增部分引物以loop引物为模板进行设计，只有当识别到结核分枝杆菌时才会触发扩增，利用上述引物组检测结核分枝杆菌灵敏度高，特异性强。
32、（2）本专利技术的设计的“锁钥”结构需要多个结核分枝杆菌的特征序列才能打开触发下游的hrca反应，提高了检测的准确性。
33、（3）针对结核分枝杆菌设计了特异性扩增引物，采用hrca方法对结核分枝杆菌进行检测，缩短了检测时间，节约了生产成本和检测成本，其检测灵敏度较好、特异性较强，提供了一种灵敏、准确且低成本的检测方案。
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1.一种基于特异性HRCA等温扩增结核分枝杆菌的序列组，其特征在于，所述序列包括Loop、Mag、Lock1、Lock2、Lock3，引物Seal，引物Branch1和Branch2，
2.根据权利要求1所述的序列组，其特征在于，所述序列组还包括识别引物组，所述识别引物组包括Block1、Block2、Block3、Key1、Key2、Key3，所述Block1、Block2、Block3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6-8所示，所述Key1、Key2、Key3的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-11所示。
3.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-2任一所述的序列组。
4.权利要求3所述的试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤，
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，与磁珠混合的所述锁的浓度为150-250nM。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述退火的温度为94-96℃
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（6）中的反应体系为：Tris-HCl的终浓度为18-22mM，(NH4)2SO4的终浓度为8-12mM，KCl的终浓度为8-12mM，MgSO4的终浓度为55-65mM，EDTA的终浓度为0.08-0.12mM，DTT的终浓度为0.8-1.2mM，Triton X-100的终浓度为0.08％-0.12%，甘油的终浓度为1-3％，支链引物对的终浓度为0.08-0.12μM，dNTPs的终浓度为0.8-1.2mM，Bst DNA聚合酶的终浓度为300-350U/μL。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤（6）的反应在60-68℃下进行0.8-1.2小时，后置于75-85℃环境8-12分钟灭活聚合酶。
...【技术特征摘要】
1.一种基于特异性hrca等温扩增结核分枝杆菌的序列组，其特征在于，所述序列包括loop、mag、lock1、lock2、lock3，引物seal，引物branch1和branch2，
2.根据权利要求1所述的序列组，其特征在于，所述序列组还包括识别引物组，所述识别引物组包括block1、block2、block3、key1、key2、key3，所述block1、block2、block3的核苷酸序列分别如seq id no.6-8所示，所述key1、key2、key3的核苷酸序列如seq id no.9-11所示。
3.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-2任一所述的序列组。
4.权利要求3所述的试剂盒在制备检测结核分枝杆菌试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤，
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，与磁...
【专利技术属性】
技术研发人员：张祯，张虎，崔键，曾昆，李金凤，王津，蔡籽年，周嘉龙，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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