【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及中药药代动力学分析，具体涉及一种布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法。
技术介绍
1、布渣叶又名破布叶、麻布叶、蓑衣子等,为椴树科植物破布叶microcospaniculata l.的干燥叶，主要分布于我国广东、海南、广西等地，属于岭南特色药、食两用植物，是两广地区多种凉茶类保健食品的主要原料之一，在民间有“凉茶瑰宝”美誉，收录于2020年版《中华人民共和国药典》。布渣叶味酸，性平，无毒，解蛊胀，清黄气，消热毒，作茶饮，去食积，研究发现布渣叶主要包含黄酮类、原花青素类、有机酸类及生物碱类成分；药理研究发现，布渣叶具有保护心血管、调血脂、促进胃肠运动、退黄、镇痛、抗炎、抗氧化、抗衰老及杀虫等作用。
2、中药化学成分复杂，经适当的途径给药后，在体内会经过吸收、分布、代谢等过程，但只有被血液吸收的成分才可能发挥治疗作用，这些成分包括原型成分和代谢产物。因此，建立灵敏、准确的测定中药入血成分方法是中药的药代动力学研究的基础。中药药代动力学可定量地说明体内药物浓度和生物效应、药物结构与药理作用的关系及药物代谢途径和作用机制等。
3、目前，布渣叶在质量控制及药理作用方面研究较多，但关于布渣叶入血成分及其药代动力学研究尚无报道，严重制约了布渣叶药效物质基础及作用机制研究。本课题组研究发现牡荆苷、异佛莱心苷、水仙苷、山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷和水杨酸在大鼠灌胃给予布渣叶醇提物后采集的血浆中可检出，而牡荆苷是2020版《中国药典》布渣叶含量测定的质量控制指标成分。因此，建立布渣叶上述5个入血
技术实现思路
1、为了克服上述技术问题，本专利技术公开了一种布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法。
2、本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：
3、一种布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，所述方法包括以下步骤：
4、步骤1，储备液的制备：分别精密称取对照品牡荆苷、异佛莱心苷、水杨酸、山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷、水仙苷置于容量瓶，加入甲醇溶解，分别得到浓度为201.880μg/ml、196.460μg/ml、502.740μg/ml、199.136μg/ml、196.255μg/ml的对照品储备液；
5、步骤2，混标工作液的配制：分别精密移取对照品储备液，稀释得到浓度为6460.16ng/ml、19646ng/ml、60328.8ng/ml、11151.62ng/ml、9812.74ng/ml的牡荆苷、异佛莱心苷、水杨酸、山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷、水仙苷混标储备液，再逐级稀释，制备不同浓度的混标工作液；
6、步骤3，内标工作液的配制：精密称取内标物磺胺甲噁唑5.13mg，加甲醇溶解，并定容至50ml，得到201.096μg/ml的内标储备液，再稀释得到2.011μg/ml的内标工作液；
7、步骤4，标准曲线工作液和质控工作液的配制：移取不同浓度的混标工作液10μl，加入100μl空白血浆和10μl内标工作液，经过前处理后，配制成一定浓度的标准曲线工作液；
8、取100μl空白血浆，加入10μl混标工作液和10μl内标工作液，经过前处理后配制成低、中、高3种浓度的质控工作液；
9、步骤5，标准曲线的建立：采用uplc-qqq-ms/ms分析对标准曲线工作液和质控工作液进行测定，以每个待测成分与内标物的峰面积比为纵坐标，待测成分的血浆浓度为横坐标，并使用1/x2作为加权因子进行加权法运算，并进行线性回归分析，获得标准曲线方程；
10、步骤6，血浆样品的处理：取100μl血浆样品，加入体积比为1：1的甲醇-乙腈混合溶液400μl和内标工作液10μl，涡旋混匀30s，-20℃冷冻1h，4℃下12000rmp离心15min，取上清液400μl，氮气吹干，加入体积比为80：20的甲醇-水混合溶液100μl，涡旋混匀30s，4℃下12000rmp离心15min，吸取80μl上层清液，备用；
11、步骤7，血浆样品的检测：取血浆样品进行uplc-qqq-ms/ms分析，根据标准曲线计算血浆样品中5个入血成分的浓度。
12、上述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其中在所述步骤7中，所述uplc-qqq-ms/ms分析的色谱条件为：色谱柱：agilent extend-c18rrhd，2.1×50mm，1.8μm；
13、流动相：乙腈为流动相a，0.1％甲酸为流动相b；
14、梯度洗脱程序为：0～0.5min，10％a；0.3～3min，10％～16％a；3～6min，16％a；6～8min，16％～20％a；8～9.5min，20％～38％a；9.5～10.5min，38％～95％a；10.5～13min，95％a；
15、流速为0.3ml/min，柱温为35℃，进样量为1μl。
16、上述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其中在所述步骤7中，所述uplc-qqq-ms/ms分析的质谱条件为：采用离子源电喷雾离子源esi源，负离子检测模式，扫描方式为多重反应监测mrm；
17、毛细管电压为3000v，干燥气温度为200℃，干燥气流量为15ml/min，雾化器压力为30psi，鞘气温度为350℃，鞘气流量为11ml/min。
18、上述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其中在所述步骤7中，内标物及5个待测成分的保留时间和质谱参数见下表：
19、
20、
21、上述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其中在所述步骤5中，5个待测成分的标准曲线方程、线性范围、相关系数及lloq见下表，结果显示各入血成分在浓度范围内各分析物线性关系良好，相关系数均大于0.99；
22、
23、上述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其中在所述步骤4中，5个待测成分的标准曲线工作液和质控工作液的质量浓度见下表：
24、
25、本专利技术的有益效果为：本专利技术针对牡荆苷、异佛莱心苷、水仙苷、山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷和水杨酸5个入血成分，以磺胺甲噁唑作为内标物，建立一种采用uplc-qqq-ms/ms定量测定5个入血成分的分析方法，本方法具有灵敏度高、稳定、准确、可靠的优点，可准确可靠地同时定量测定大鼠灌胃给予布渣叶醇提物后不同时间点所得血浆中5个入血成分的浓度，实现准确同时定量测定布渣叶醇提物中的5个成分，并应用于布渣叶醇提物的药代动力学研究，对布渣叶药用资源的深入开发及临床应用具有指导意义。
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1.一种布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，在所述步骤7中，所述UPLC-QQQ-MS/MS分析的色谱条件为：色谱柱：Agilent Extend-C18RRHD，2.1×50mm，1.8μm；
3.根据权利要求2所述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，在所述步骤7中，所述UPLC-QQQ-MS/MS分析的质谱条件为：采用离子源电喷雾离子源ESI源，负离子检测模式，扫描方式为多重反应监测MRM；
4.根据权利要求3所述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，在所述步骤7中，内标物及5个待测成分的保留时间和质谱参数见下表：
5.根据权利要求1所述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，在所述步骤5中，5个待测成分的标准曲线方程、线性范围、相关系数及LLOQ见下表，结果显示各入血成分在浓度范围内各分析物线性关系良好，相关系数均大于0.99；
...【技术特征摘要】
1.一种布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，在所述步骤7中，所述uplc-qqq-ms/ms分析的色谱条件为：色谱柱：agilent extend-c18rrhd，2.1×50mm，1.8μm；
3.根据权利要求2所述的布渣叶醇提物中5个入血成分的同时定量测定方法，其特征在于，在所述步骤7中，所述uplc-qqq-ms/ms分析的质谱条件为：采用离子源电喷雾离子源esi源，负离子检测模式，扫描方式为多重反应监测mrm；
【专利技术属性】
技术研发人员：肖观林，毕晓黎，胥爱丽，李素梅，张靖年，陈伟韬，李养学，汤瑞茵，
申请(专利权)人：广东省第二中医院广东省中医药工程技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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