【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种利用柱层析对抗体糖基化修饰水平进行控制的方法。
技术介绍
1、随着生物技术及工程的不断发展与进步，生物医药制品呈现爆发增长态势，病患需求日益显著，这其中抗体药物的优势凸显的越来越重要。对含有目标抗体培养物进行分离纯化，并获得高质量符合预期的抗体产品是其生产过程中必不可少的步骤。如何通过优化抗体的纯化条件，增强去除杂质的效率，提高抗体产品的质量是目前工业化生产中重要的问题。
2、随着上游细胞培养技术的成熟与不断改进，表达量不断提高，目标蛋白的杂质含量也更加明显，对下游纯化工艺提出了更高的要求。目前下游技术手段对电荷异构体、聚集体、片段等组分去除效果较为明显，但对于非预期的糖基化修饰去除手段较为有限。据报道，糖基化修饰对抗体的活性、免疫原性、半衰期等均有较大影响，特别是非f糖的糖基化修饰，特别是man5糖基化修饰水平，对抗体半衰期及adcc活性均有较大影响。因此，需通过合适的纯化工艺对抗体分子的糖基化修饰水平进行优化。
技术实现思路
1、本专利技术目的是一种利用柱层析优化糖基化修饰的方法，特别是能有效去除非预期的非f糖的糖基化修饰，特别是针对man5糖基化修饰的杂质去除。在本专利技术中，利用阳离子交换层析或者复合模式层析，通过控制收集点实现对抗体分子的非预期糖基化修饰杂质去除的目的，从而得到符合预期的抗体分子。
2、本专利技术提供的一个技术方案为：柱层析在用于对抗体糖基化修饰水平进行控制中的用途，所述用途包括如下步骤：p>
3、(1)用低ph的平衡缓冲液对柱层析的层析柱进行平衡，随后将含有抗体分子的样品进行上样，使抗体分子吸附到层析介质上，上样结束后用平衡缓冲液进行冲洗；
4、(2)以平衡缓冲液为a相，以高ph高电导率的缓冲液为b相，进行线性洗脱，收集洗脱组分即可实现对抗体分子糖基化修饰水平的优化；
5、所述柱层析是指阳离子交换层析和/或复合模式层析；
6、所述糖基化修饰是指非f糖的糖基化修饰，优选的，是指针对man5糖的修饰。
7、优选的，所述柱层析所使用的平衡缓冲液为柠檬酸盐，醋酸盐和/或磷酸盐，ph值为4.5～5.5，盐浓度为30～80mmol/l。
8、优选的，所述b相缓冲液含有120～180mmol/l的nacl，ph值为5.2～8.0。
9、优选的，所述阳离子交换层析所用填料的基架为交联琼脂糖、配基为磺酸基类，优选的为capto spimpres。
10、优选的，所述复合模式层析所用填料的基架为亲水聚乙烯醚聚合物、配基为羰基和烃基类，优选的为eshmuno cmx；
11、或所用填料的基架为交联琼脂糖、配基为羰基和烃基类，优选的为capto mmcimpres；
12、或所用填料的基架为交联琼脂糖、配基为羰基、氢键和疏水基团类，优选的为maxtar mmc hr。
13、优选的，所述线性洗脱为b相在15～20个柱体积内流速比例由0％升高至100％。
14、优选的，所述收集洗脱组分步骤具体为根据uv280的吸收值收集洗脱组分。
15、本专利技术提供的另一个技术方案为：柱层析在用于对抗体糖基化修饰水平进行控制中的用途，包括如下步骤：
16、(1)平衡：用平衡缓冲液冲洗层析柱3～5柱体积；所用平衡缓冲液为20mmol柠檬酸+20mmol磷酸二氢钠+80mmol nacl，ph5.0±0.5；
17、(2)上样：对含有抗体分子的样品液进行上样，使其结合到层析介质上，载量≤20g/l；
18、(3)上样后平衡：用平衡缓冲液冲洗层析柱3～5柱体积；所用平衡缓冲液为20mmol柠檬酸+20mmol磷酸二氢钠+80mmol nacl，ph5.0±0.5；
19、(4)洗脱：以平衡缓冲液和缓冲液b进行线性洗脱，收集洗脱液,其中线性洗脱为b相在15～20个柱体积内流速比例由0％升高至100％，缓冲液b含有10mmol/l柠檬酸，20～60mmol/l磷酸二氢钠，120～150mmol/l nacl。
20、本专利技术提供的另一个技术方案为：柱层析在用于对抗体糖基化修饰水平进行控制中的用途，包括如下步骤：
21、(1)平衡：用平衡缓冲液冲洗层析柱3～5柱体积；所用平衡缓冲液为10mmol/l醋酸-醋酸钠，ph5.0±0.5；
22、(2)上样：对含有抗体分子的样品液进行上样，使其结合到层析介质上，载量≤20g/l；
23、(3)上样后平衡：用平衡缓冲液冲洗层析柱3～5柱体积；所用平衡缓冲液为10mmol/l醋酸-醋酸钠，ph5.0±0.5；
24、(4)洗脱：以平衡缓冲液和缓冲液b进行线性洗脱，收集洗脱液,其中线性洗脱为b相在15～20个柱体积内流速比例由0％升高至100％，缓冲液b含有0.01mol/l的醋酸-醋酸钠，130mmol氯化钠，ph为5.2。
25、本专利技术具有以下有益效果：
26、本专利技术利用阳离子交换层析和/或复合模式层析，对初步纯化的抗体分子进行糖型优化，并收集柱层析后的样品进行检测。经检测，本专利技术制备的目的抗体样品的非f糖的糖基化修饰降低了约0.7％，特别是man5的糖基化修饰水平比优化前降低了约0.6％，产品的adcc活性由优化前的126％降至110％左右，与参考品基本一致。本专利技术的特点是在过程中使用了较为合适的层析介质，控制了合理的上样载量，且所使用的缓冲液，采用了合适的离子强度和ph值，并通过合理控制洗脱过程样品的收集区间，确保了产品中糖基化的修饰水平，并保证了样品的adcc活性。本专利技术所述的制备工艺具有快速、简便、规模易放大，适合大规模生产等特点。
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1.柱层析在用于对抗体糖基化修饰水平进行控制中的用途，其特征在于，所述用途包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：
3.如权利要求1-2任一项所述的用途，其特征在于：
4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于：
5.如权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于：
6.如权利要求1-5任一项所述的用途，其特征在于：
7.如权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于：包括如下步骤：
8.如权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于：包括如下步骤：
【技术特征摘要】
1.柱层析在用于对抗体糖基化修饰水平进行控制中的用途，其特征在于，所述用途包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：
3.如权利要求1-2任一项所述的用途，其特征在于：
4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于：
...【专利技术属性】
技术研发人员：孙波，贾国栋，蔺菲菲，张守雨，朱志凯，邢婷婷，杨利，安振明，孙丽霞，刘骏，
申请(专利权)人：齐鲁制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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