【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本文公开的实施例涉及植物分子生物学领域，包括用于赋予植物抗昆虫性的dna构建体。本文公开的实施例还包括含有事件das-01131-3的抗昆虫玉米植物以及用于检测样品及其组合物中事件das-01131-3的存在的测定。
技术介绍
1、玉米是重要的作物，并且是世界许多地区的主要食物来源。尽管使用了诸如化学杀有害生物剂等保护性措施，但昆虫有害生物引起的损害仍是造成世界上玉米作物损失的主要因素。鉴于此，为了控制昆虫损害并减少对传统化学杀有害生物剂的需求，已经将抗昆虫性经过基因工程改造到诸如玉米等作物中。已用于生产转基因抗昆虫作物的一组基因是来自苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)的δ-内毒素组。δ-内毒素已在诸如棉花、马铃薯、水稻、向日葵以及玉米等作物植物中成功表达，并在某些情况下已证明可很好地控制昆虫有害生物。(perlak,f.j等人(1990)bio/technology[生物技术]8:939-943；perlak,f.j.等人(1993)plant mol.biol.[植物分子生物学]22:313-321；fujimoto,h.等人(1993)bio/technology[生物技术]11:1151-1155；tu等人,(2000)naturebiotechnology[自然生物技术]18:1101-1104；pct公开wo 01/13731；和bing,j.w.等人(2000)efficacy of cry1f transgenic maize[cry1f转基因玉米的功效],14th bienni
2、已知转基因在植物中的表达受许多不同因素的影响，包括驱动单个目的基因表达的表达盒的方向和组成，以及植物基因组中的位置，这可能是由于染色质的结构(例如异染色质)或转录调节元件(例如增强子)靠近整合位点的近距离(weising等人(1988)ann.rev.genet.[遗传学年鉴]22:421-477)。
3、能够检测特定事件的存在以便确定有性杂交的子代是否包含目的转基因将是有利的。
4、通过核酸检测方法，例如通过聚合酶链反应(pcr)或使用核酸探针的dna杂交，可以检测转基因的存在。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，诸如启动子、终止子、标记基因等，因为对于许多dna构建体而言，编码区是可互换的。结果，除非与插入的异源dna相邻的侧翼dna的dna序列是已知的，否则此类方法可能无法用于区分不同的事件，特别是使用相同dna构建体或非常相似的构建体产生的事件。
技术实现思路
1、实施例涉及抗昆虫玉米(玉蜀黍(zea mays))植物事件das-01131-3，也称为“玉米系das-01131-3”、“玉米事件das-01131-3”和“das-01131-3玉米”，涉及玉米植物事件das-01131-3的dna植物表达构建体，并且涉及用于检测玉米植物事件das-01131-3及其子代中的转基因构建体、侧翼和插入(靶基因座)区域的方法和组合物。
2、在一个方面，这些组合物和方法涉及产生和选择抗昆虫单子叶作物植物的方法。组合物包括dna构建体，该dna构建体在植物细胞和植物中表达时赋予对昆虫的抗性。在一个方面，提供了一种能够引入宿主细胞中并在宿主细胞中复制的dna构建体，该dna构建体在植物细胞和植物中表达时赋予这些植物细胞和植物抗昆虫性。玉米事件das-01131-3是通过农杆菌属(agrobacterium)介导的质粒php88492转化而产生的(图1)。如本文所述，这些事件包括cry1da2基因(多核苷酸seq id no:4、编码氨基酸seq id no:5)盒(表1)，其赋予对某些鳞翅目植物有害生物的抗性。昆虫控制组分已证明对鳞翅目昆虫物种有功效。
3、质粒php88492的t-dna区域示意性地表示在图2中，其序列以seq id no:2提供。质粒php88492的t-dna含有两个基因盒。
4、第一个盒(cry1da2基因盒)含有嵌合基因，该嵌合基因由来自编码杀昆虫核心毒素的cry1da2基因和cry1ab基因的衍生物的序列构成，两者均衍生自苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)(美国专利9890390[tan等人,2018])。表达的cry1da2蛋白赋予对某些鳞翅目有害生物的控制。cry1da2蛋白长度为603个氨基酸，包括衍生自cry1ab的最后9个氨基酸，分子量为约68kda(图3)。cry1da2基因的表达由来自玉米泛素基因1(ubizm1)的启动子区域控制，包括5'非翻译区(utr)和内含子(christensen等人,1992)。cry1da2基因的终止子是来自ubizm1基因的终止子区域(christensen等人,1992；美国专利9688996[kumar等人,2017])。
5、第二个盒(dgt-28epsps基因盒)含有衍生自斯维链霉菌(streptomyces sviceus)的5-烯醇式丙酮酸莽草酸酯-3-磷酸合酶(epsps)基因，与来自甘蓝型油菜(brassicanapus)和芜菁(brassica rapa)的嵌合叶绿体转运肽(多核苷酸seq id no:6和氨基酸seqid no:7)、trap8(多核苷酸seq id no:8和氨基酸seq id no:9)融合(wo专利2013116700[lira等人,2013]；griffin等人,2021)。表达的dgt-28epsps蛋白通过trap8肽靶向玉米叶绿体，以提供对草甘膦除草剂的耐受性。推导的dgt-28epsps基因的表达产生具有481个氨基酸的总长度和约51kda的分子量的前体蛋白，其包括65个氨基酸的trap8肽以及2个氨基酸接头。dgt-28epsps基因的表达受第二拷贝的ubizm1启动子(包括5’utr和内含子)和第二拷贝的ubizm1终止子控制。
6、php88492 t-dna含有两个attb重组位点(attb1和attb2)、两个工程改造的着陆垫区域(elp1区域1和elp1区域2)和四个锌指核酸酶靶识别位点(zfn)(分别为hartley等人,2000和katzen,2007；美国专利10160975[ainley等人,2018]；ainley等人,2013)。单独存在这些位点不会引起任何重组，因为为了发挥作用，这些位点需要植物中不天然存在的特定重组酶(cox,1988；dale和ow,1990；thorpe和smith,1998)。
7、根据一些实施例，提供了用于鉴定命名为das-01131-3的新型玉米植物(即，具有事件das-01131-3的植物，如保藏在atcc保藏号pta-127077中)的组合物和方法。这些方法基于特异性识别das-01131-3的5'和本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含玉米事件DAS-01131-3的基因型的玉米植物，其中所述基因型包含如SEQID NO:22和SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述基因型包含SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:26具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述基因型包含SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:27具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
4.一种DNA构建体，其包含两个可操作地连接的表达盒，其中所述表达盒中的一个包含：
5.一种植物，其包含如权利要求4所述的DNA构建体。
6.如权利要求5所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
7.一种植物，其包含SEQ ID NO:19所示的序列或与SEQ ID
8.一种玉米事件DAS-01131-3，其中所述玉米事件种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为PTA-127077。
9.如权利要求8所述的玉米事件的植物部分。
10.一种包含玉米事件DAS-01131-3的种子，其中所述种子包含选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25的DNA分子，其中所述玉米事件DAS-01131-3种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为PTA-127077。
11.一种玉米植物或其部分，所述玉米植物或其部分从如权利要求10所述的种子生长而来。
12.一种转基因种子，其由如权利要求8所述的玉米植物产生。
13.一种转基因玉米植物或其部分，所述转基因玉米植物或其部分从如权利要求12所述的种子生长而来。
14.一种分离的核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:19和22-27的核苷酸序列及其全长互补序列。
15.一种扩增子，其包含选自SEQ ID NO:19-21的核酸序列及其全长互补序列。
16.一种衍生自玉米事件DAS-01131-3植物、组织或种子的生物学样品，其中所述样品包含作为选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25的序列或与所述序列互补的核苷酸序列，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述样品中检测所述核苷酸序列，其中所述玉米事件DAS-01131-3种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为PTA-127077。
17.如权利要求16所述的生物学样品，其中所述生物学样品包括转基因玉米事件DAS-01131-3的植物、植物组织或种子。
18.如权利要求17所述的生物学样品，其中所述生物学样品是从所述转基因玉米植物事件DAS-01131-3提取的DNA样品，并且其中所述DNA样品包含选自SEQ ID NO:19-27的一个或多个核苷酸序列及其互补序列。
19.如权利要求16所述的生物学样品，其中所述生物学样品选自玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物。
20.一种提取物，其衍生自玉米事件DAS-01131-3植物、组织或种子，并且包含作为选自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:25的序列或与所述序列互补的核苷酸序列，其中所述玉米事件DAS-01131-3种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为PTA-127077。
21.如权利要求20所述的提取物，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述提取物中检测所述核苷酸序列。
22.如权利要求21所述的提取物，其中所述提取物包含转基因玉米植物事件DAS-01131-3的植物、植物组织或种子。
23.如权利要求22所述的提取物，其中所述提取物是选自玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物的组合物，其中所述组合物包含可检测量的所述核苷酸序列。
24.一种产生杂交玉米种子的方法，所述方法包括：
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一玉米近交系为雌性亲本或雄性亲本。
26.一种用于产生抗鳞翅目有害生物的玉米植物的方法，所述方法包括：
27.一种产生杂交玉米种子的...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种包含玉米事件das-01131-3的基因型的玉米植物，其中所述基因型包含如seqid no:22和seq id no:25所示的核苷酸序列或与seq id no:22和seq id no:25具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述基因型包含seq id no:23和seq id no:26所示的核苷酸序列或与seq id no:23和seq id no:26具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的玉米植物，其中所述基因型包含seq id no:24和seq id no:27所示的核苷酸序列或与seq id no:24和seq id no:27具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
4.一种dna构建体，其包含两个可操作地连接的表达盒，其中所述表达盒中的一个包含：
5.一种植物，其包含如权利要求4所述的dna构建体。
6.如权利要求5所述的植物，其中所述植物是玉米植物。
7.一种植物，其包含seq id no:19所示的序列或与seq id no:19具有至少95％序列同一性的序列。
8.一种玉米事件das-01131-3，其中所述玉米事件种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，保藏号为pta-127077。
9.如权利要求8所述的玉米事件的植物部分。
10.一种包含玉米事件das-01131-3的种子，其中所述种子包含选自seq id no:22和seq id no:25的dna分子，其中所述玉米事件das-01131-3种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，保藏号为pta-127077。
11.一种玉米植物或其部分，所述玉米植物或其部分从如权利要求10所述的种子生长而来。
12.一种转基因种子，其由如权利要求8所述的玉米植物产生。
13.一种转基因玉米植物或其部分，所述转基因玉米植物或其部分从如权利要求12所述的种子生长而来。
14.一种分离的核酸分子，其包含选自seq id no:19和22-27的核苷酸序列及其全长互补序列。
15.一种扩增子，其包含选自seq id no:19-21的核酸序列及其全长互补序列。
16.一种衍生自玉米事件das-01131-3植物、组织或种子的生物学样品，其中所述样品包含作为选自seq id no:22和seq id no:25的序列或与所述序列互补的核苷酸序列，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述样品中检测所述核苷酸序列，其中所述玉米事件das-01131-3种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，保藏号为pta-127077。
17.如权利要求16所述的生物学样品，其中所述生物学样品包括转基因玉米事件das-01131-3的植物、植物组织或种子。
18.如权利要求17所述的生物学样品，其中所述生物学样品是从所述转基因玉米植物事件das-01131-3提取的dna样品，并且其中所述dna样品包含选自seq id no:19-27的一个或多个核苷酸序列及其互补序列。
19.如权利要求16所述的生物学样品，其中所述生物学样品选自玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物。
20.一种提取物，其衍生自玉米事件das-01131-3植物、组织或种子，并且包含作为选自seq id no:22和seq id no:25的序列或与所述序列互补的核苷酸序列，其中所述玉米事件das-01131-3种子的代表性样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc)，保藏号为pta-127077。
21.如权利要求20所述的提取物，其中可使用核酸扩增或核酸杂交方法在所述提取物中检测所述核苷酸序列。
22.如权利要求21所述的提取物，其中所述提取物包含转基因玉米植物事件das-01131-3的植物、植物组织或种子。
23.如权利要求22所述的提取物，其中所述提取物是选自玉米细粉、玉米粗粉、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉和以整体或部分制造而包含玉米副产物的谷物的组合物，其中所述组合物包含可检测量的所述核苷酸序列。
24.一种产生杂交玉米种子的方法，所述方法包括：
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述第一玉米近交系为雌性亲本或雄性亲本。
26.一种用于产生抗鳞翅目有害生物的玉米植物的方法，所述方法包括：
27.一种产生杂交玉米种子的方法，所述方法包括：
28.如权利要求26所述的方法，其进一步包括以下步骤：将包含玉米事件das-01131-3的第二代子代植物与缺少所述玉米事件das-01131-3dna的亲本植物回交，从而产生抗鳞翅目有害生物的回交子代植物。
29.一种确定生物学样品中包含事件das-01131-3的玉米植物的接合性的方法，所述方法包括：
30.如权利要求29所述的方法，其中所述第一对dna分子包含引物对seq id no:10和11。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述第一和第二对dna分子包含可检测标记。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述可检测标记是荧光标记。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述可检测标记与所述引物分子中的一个或多个共价结合。
34.一种检测包含玉米核酸的样品中事件das-01131-3所特有的核酸分子的存在的方法，所述方法包括：
35.如权利要求34所述的方法，其中可判断事件das-01131-3的核酸分子是由核酸扩增链反应产生的扩增子。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述样品与探针接触。
37.如权利要求36所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·阿斯百里，B·聪，V·克雷恩，J·E·金，J·S·穆蒂，D·奥尼尔，M·A·帕斯夸尔，M·M·范戴克，P·王，A·T·伍斯利，S·E·沃登，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：
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