【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种镰刀菌蛋白激酶、编码基因、蛋白激酶缺失基因突变菌株及其构建方法和它们的应用，特别涉及镰刀菌产纤维素酶、木聚糖酶调控相关基因，尤其涉及调控镰刀菌利用纤维素、半纤维素产乙醇的应用。
技术介绍
1、我国农作物秸秆等纤维素资源丰富，以纤维素为原料生产生物燃料乙醇具有“不与人争粮、不与粮争地”的原料优势，不仅可以降碳、减污，还能缓解能源危机，促进人与自然和谐共生。联合生物加工法生产乙醇是将纤维素酶的生产、纤维素的酶解、糖酵解成酒精等过程由一种微生物或微生物集合体同时在一个反应器中完成。具有生产流程简单、投入少、效率高等优点，被广泛认为是最优的纤维素乙醇生产策略。
2、镰刀菌产纤维素酶，半纤维素酶能力强，可利用己糖和戊糖发酵生产乙醇，且对乙醇、乙酸等代谢产物的耐受性强，是将纤维素直接转化为燃料乙醇的优势微生物，在的联合生物加工法利用纤维素制乙醇产业上极具应用潜力。但是，目前镰刀菌的综合性状离联合生物加工的要求还有一定距离，仍需继续筛选产纤维素酶、木聚糖酶能力强，产乙醇效率高的镰刀菌菌株，并加强对其纤维素酶调控机制和糖酵解产乙醇相关代谢途径和机制研究，以通过基因工程的手段对其进行改良，构建适用于生产应用的工程菌株。
3、植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素等物质组成，其中木聚糖类半纤维素在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素。强劲的纤维素、木聚糖降解能力是联合生物加工法利用纤维素制乙醇对微生物的基本要求，在镰刀菌中，蛋白激酶与该菌纤维素酶、木聚糖酶产生的具体调控关系仍不清楚，需该领域的
技术实现思路
1、为进一步提高镰刀菌纤维素酶、木聚糖酶的产量，满足工业生产要求，本专利技术的首要目的是提供一种调控镰刀菌纤维素酶、木聚糖酶产量的蛋白激酶foime2及其编码基因foime2，并提供其提高镰刀菌纤维素酶、木聚糖酶产量的应用方法。通过构建镰刀菌的foime2基因缺失突变体，可显著提高镰刀菌纤维素酶、木聚糖酶的产量，且工程菌株的纤维素酶、木聚糖酶产量不受葡萄糖的阻遏调控，在高浓度葡萄糖条件下，工程菌株的纤维素酶、木聚糖酶产量不仅不会降低，反而会显著升高。
2、本专利技术的目的是通过以下方式实现的：
3、一种镰刀菌蛋白激酶(命名为foime2)，其氨基酸序列如seq id no.1所示。所述的镰刀菌蛋白激酶编码基因(命名为foime2)，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
4、应用方面，本专利技术提供了降低镰刀菌蛋白激酶的表达，或者敲除镰刀菌蛋白激酶基因在提高镰刀菌木聚糖酶、纤维素酶产量中的应用。
5、本专利技术还提供了一种蛋白激酶基因缺失镰刀菌工程菌株；所述的蛋白激酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
6、所述的蛋白激酶基因缺失镰刀菌工程菌株的构建方法，通过构建载体质粒和pcr扩增的方法，分别得到含有镰刀菌蛋白激酶编码基因上游核苷酸序列和带启动序列的新霉素抗性基因5’端2/3核苷酸序列片段，以及带终止序列的新霉素抗性基因3’端2/3核苷酸序列片段与蛋白激酶编码基因下游核苷酸序列的融合片段；
7、通过peg-cacl2介导的原生质的转化方法，将上述两个融合片段转入镰刀菌原生质体中，通过新霉素抗性平板筛选培养即筛选到敲除了镰刀菌蛋白激酶编码基因的镰刀菌，获得高产纤维素酶、木聚糖酶的镰刀菌工程菌株。
8、进一步地，具体包括以下步骤：
9、1)以seq id no.3、seq id no.4为引物扩增镰刀菌基因组dna，得到镰刀菌蛋白激酶编码基因上游臂片段1；
10、2)将片段1连入具新霉素抗性基因载体质粒中；连入点位于新霉素抗性基因启动子的上游；
11、3)以seq id no.5和seq id no.6为引物，具片段1的质粒为模板，扩增得到含有镰刀菌蛋白激酶编码基因上游核苷酸序列和带启动序列的新霉素抗性基因5’端2/3核苷酸序列片段；
12、4)以seq id no.7、seq id no.8为引物扩增镰刀菌基因组dna得到镰刀菌蛋白激酶编码基因下游臂片段4；
13、5)将片段2连入具新霉素抗性基因载体质粒中；连入点位于新霉素抗性基因启动子的下游；
14、6)以seq id no.9、seq id no.10为引物，具片段2的质粒为模板，融合扩增得到带终止序列的新霉素抗性基因3’端2/3核苷酸序列片段与蛋白激酶编码基因下游核苷酸序列的融合片段。
15、本专利技术最后还提供了所述的蛋白激酶基因缺失镰刀菌工程菌株在提高镰刀菌纤维素酶、木聚糖酶产量中的应用。
16、本专利技术有益效果：本专利技术获得了一种调控纤维素酶、木聚糖酶产生和葡萄糖代谢的镰刀菌的蛋白激酶(foime2)及其编码基因(foime2)，并通过基因敲除手段证明了该基因在镰刀菌中作用，发现基因敲除后构建的镰刀菌foime2基因缺失突变体，可显著提高镰刀菌纤维素酶、木聚糖酶的产量，且工程菌株的纤维素酶、木聚糖酶产量不受葡萄糖的阻遏调控，在高浓度葡萄糖条件下，镰刀菌的纤维素酶、木聚糖酶产量不仅不会降低，反而会显著升高。本专利技术不仅对镰刀菌致病的机理研究提供了理论支持和实验数据支持，也为后续通过转基因技术构建超级工程菌株提供了候选基因支持。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种镰刀菌蛋白激酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种镰刀菌蛋白激酶编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.降低镰刀菌蛋白激酶的表达，或者敲除镰刀菌蛋白激酶基因在提高镰刀菌木聚糖酶、纤维素酶产量中的应用。
4.一种蛋白激酶基因缺失镰刀菌工程菌株，所述的蛋白激酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.权利要求4所述的蛋白激酶基因缺失镰刀菌工程菌株的构建方法，其特征在于，通过构建载体质粒和PCR扩增的方法，分别得到含有镰刀菌蛋白激酶编码基因上游核苷酸序列和带启动序列的新霉素抗性基因5’端2/3核苷酸序列片段，以及带终止序列的新霉素抗性基因3’端2/3核苷酸序列片段与蛋白激酶编码基因下游核苷酸序列的融合片段；
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
7.权利要求4-6任一项所述的蛋白激酶基因缺失镰刀菌工程菌株在提高镰刀菌纤维素酶、木聚糖酶产量中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种镰刀菌蛋白激酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.一种镰刀菌蛋白激酶编码基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
3.降低镰刀菌蛋白激酶的表达，或者敲除镰刀菌蛋白激酶基因在提高镰刀菌木聚糖酶、纤维素酶产量中的应用。
4.一种蛋白激酶基因缺失镰刀菌工程菌株，所述的蛋白激酶，其氨基酸序列如seq idno.1所示，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
5.权利要求4所述的蛋白激酶基因缺失镰...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖姬玲，梁志怀，
申请(专利权)人：湖南省农业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。