【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，本专利技术涉及一种可以提高多结构域纳米颗粒产量的方法。
技术介绍
1、蛋白纳米载体在药物递送、疫苗构建等领域有诸多应用。例如，蛋白类纳米颗粒由于其生产工艺简便可控、制造成本低廉、生物兼容性好，被认为是未来最具有潜力的疫苗元件。目前，主流的蛋白纳米载体主要分为两类：一种为天然来源的蛋白纳米颗粒，如病毒样颗粒vlp或铁蛋白颗粒等，通常由单一蛋白自组装形成，能够在其表面高度重复呈现抗原，构成特殊的pamps，从而有利于抗原提呈细胞的成熟，并刺激产生较强的b细胞和t细胞反应，有效提升亚单位疫苗的抗体效价；另一种蛋白纳米颗粒为人工设计的自组装蛋白纳米颗粒，可通过设计构建螺旋-螺旋结构的蛋白单体，自组装成具有高级结构的纳米颗粒，如铁蛋白与流感血凝素ha融合表达后可形成10nm的多聚结构，较流感灭活疫苗能够激发更强烈的免疫应答。相比于病毒样颗粒，蛋白自组装纳米颗粒的优势在于其单体低聚的螺旋结构具有多个结构域，因而具有更丰富的多样性设计，可根据需求进行不同的组合，形成不同多聚的几何结构。然而，这种人工设计的多结构域自组装蛋白，与天然来源的蛋白纳米颗粒相比，常呈现出更低的可溶性，导致产量低、价格高，不能满足实际的工业化应用场景，例如david baker教授在2016年利用ai设计了183种人工的蛋白纳米颗粒，但是其中只有12种设计呈现比较高的可溶性，可用于后续的实验(bale jb,gonen s,liu y,sheffler w,ellisd,thomas c,cascio d,yeates to,gonen t,king
技术实现思路
1、专利技术人发现将两个或更多个功能结构域的融合蛋白，例如分别由受体结合结构域ctb和生物素结合结构域sa构成的ctbsa融合蛋白的结构域之间使用含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列(也称作linker)连接后，减低了融合蛋白纳米颗粒的等电点，提高了纳米颗粒的溶解性进而提高了ctbsa纳米颗粒的表达产量。由此提供了以下专利技术。
2、在一个方面，本专利技术提供了提高多结构域纳米颗粒产量的方法，其包括在多结构域之间，优选两个结构域之间使用含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列连接。该方法中具体的载体构建、菌株表达是本领域的常规技术，本领域技术人员也可以参照后附实施例实施。
3、在进一步的方面，本专利技术提供了提高多结构域纳米颗粒产量的方法，其包括在多结构域之间，优选两个结构域之间使用连接序列f40。f40是噬菌体鞭毛蛋白的前40个氨基酸，带有2个净负电荷。在某些示例性实施方案中，所述f40具有seq id no:9所示的氨基酸序列。
4、在更进一步的方面，本专利技术提供了提高多结构域纳米颗粒产量的方法，其包括在多结构域之间，优选两个结构域之间使用连接序列s。连接序列s是新型冠状病毒s蛋白的颈部螺旋氨基酸，带有5个净负电荷。在某些示例性实施方案中，所述s具有seq id no:11所示的氨基酸序列。
5、在另一个方面，本专利技术提供根据本专利技术方法获得的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其中结构域之间包含含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列。
6、在进一步的方面，所述多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒优选为双结构域融合蛋白或双结构域纳米颗粒。更优选地双结构域为结构域ctb和结构域sa。
7、由于霍乱毒素b亚单位(ctb)、志贺毒素b亚单位(stxb)、大肠杆菌不耐热性肠毒素b亚单位(ltb)和枯草杆菌毒素b亚单位(subb)同属于ab5毒素家族的b亚基，都具有一个寡糖/寡核苷酸结合结构域，该结构域由一个五股螺旋的β-桶状结构和两侧的α-螺旋组成，它们组装形成一个同源五聚体、环状支架结构，空间构象非常相似(参见travis beddoe等，structure,biological functions and applications of the ab5 toxins，trends inbiochemical sciences 35(2010)411-418)，并且在功能上均负责与宿主细胞表面结合，催化a亚单位破坏宿主的细胞。所以，本领域可以预期，stxb、ltb和subb与ctb一样，也具有本专利技术的技术效果，即在结构域stxb、ltb或subb与结构域sa之间使用含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列能够使所形成的融合蛋白或纳米颗粒产量提高。因此，在本专利技术申请中，更优选地，双结构域为结构域stxb、ltb或者subb和结构域sa。
8、在进一步的方面，所述含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列为s序列或f40序列，优选具有seq id no:9所示氨基酸序列的f40序列和具有seq id no:11所示氨基酸序列的s序列。
9、在进一步的方面，所述多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒优选还包含糖基化序列，优选具有seq id no.5所示氨基酸序列的pile s45～k73序列。
10、术语定义
11、在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的微生物学、免疫学、生物化学、核酸化学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
12、在本专利技术申请中，术语“连接序列”与“linker”含义相同并且可以互换使用，是指位于两个结构域之间起连接作用的氨基酸链，其允许两侧的结构域完成各自独立的功能，其通常包含3个以及以上的氨基酸。
13、在本专利技术申请中，术语“酸性氨基酸”指含羧基数量超过氨基数量的氨基酸，包括谷氨酸和天冬氨酸，或其他非天然氨基酸。
14、在本专利技术申请中，术语“净负电荷”指连接序列中存在不能被抵消的负电荷。本领域技术人员可以根据具体的氨基酸序列容易地确定连接序列是否为净负电荷。
15、在本专利技术申请中，术语“净负电荷数”指连接序列中存在的不能被抵消的负电荷的数量。
16、在本专利技术申请中，术语“等电点”或“pi”是指融合蛋白分子表面不带电荷时的ph值。
17、在本专利技术申请中，术语“多结构域”指两个或以上个结构域。术语“双结构域”指两个结构域。
18、如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提高多结构域纳米颗粒产量的方法，其包括在多结构域之间使用含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列连接。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的连接序列为SEQ ID NO.9所示的F40序列或者SEQID NO.11所示的S序列。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的多结构域为双结构域。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的双结构域为结构域CTB、StxB、LTB或者SubB和结构域SA。
5.根据权利要求1的方法得到的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其包含多个结构域，并且多个结构域之间通过含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列连接。
6.权利要求5所述的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其中所述的连接序列为SEQ ID NO.9所示的F40序列或者SEQ ID NO.11所示的S序列。
7.根据权利要求5或6所述的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其中所述的多个结构域为双结构域。
8.权利要求7所述的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其中所述的双结构域为结构域CTB、StxB、
9.权利要求5-8任一项所述的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其还包含糖基化序列。
10.权利要求9所述的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其中所述的糖基化序列为SEQ ID NO.5所示的序列。
...【技术特征摘要】
1.一种提高多结构域纳米颗粒产量的方法，其包括在多结构域之间使用含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列连接。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的连接序列为seq id no.9所示的f40序列或者seqid no.11所示的s序列。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述的多结构域为双结构域。
4.权利要求3所述的方法，其中所述的双结构域为结构域ctb、stxb、ltb或者subb和结构域sa。
5.根据权利要求1的方法得到的多结构域融合蛋白或多结构域纳米颗粒，其包含多个结构域，并且多个结构域之间通过含有酸性氨基酸且具有净负电荷的连接序列连接。
6.权利要求5...
【专利技术属性】
技术研发人员：王恒樑，朱力，李湘，潘超，吴军，余淑娟，郭艳，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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