【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞冻存，具体涉及一种非程序无血清冻存液及其应用。
技术介绍
1、细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
2、现有细胞冻存方法主要有程序降温和非程序降温两种方式，程序降温是指逐步缓慢降低细胞保存温度至-80℃，随后置于液氮内(-196℃)长期保存，非程序降温指不经过程序降温过程直接将细胞置于-80℃，非程序降温操作更为方便可控，因而使用较多。细胞冻存过程中由于温度快速降低，会在细胞内外形成较多冰晶，对细胞造成损伤，进而影响复苏后细胞活力和增殖效率。
3、细胞冻存时加入冻存液作为保护剂，可有效避免细胞损伤。冻存液通常由二甲基亚砜(dmso)、胎牛血清(fbs)和缓冲溶剂组成，但fbs属于动物源性物质，成分比较复杂，品质较难控制，在应用上存在潜在的风险，也增加了污染的几率，因而无血清的冻存液适用范围更广。现有技术，如专利申请cn202110846550.5公开了一种用于直接液氮冻存的无血清无蛋白冻存液，由海藻糖、糖酐4万(葡聚糖4万)、羟乙基淀粉、dmso、还原型谷胱甘肽、l-谷氨酰胺、谷丙二肽、丙酮酸钠和pbs组成。如专利申请cn202010777373.5公开了一种自体脂肪细胞冻存液及脂肪间
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术旨在开发一种适用范围广泛的非程序无血清冻存液，其不含血清等动物源成分，也无需耗时的程序冷冻保存步骤，细胞重悬后可直接冷冻，且复苏后细胞活力维持良好。
2、本专利技术的技术方案具体如下：
3、本专利技术第一方面提供了一种非程序无血清冻存液，包括羧甲基海藻糖、抗氧化保护剂、l-脯氨酸、渗透性保护剂和溶剂。
4、优选地，在上述非程序无血清冻存液中，抗氧化保护剂包括维生素c(vc)和硫辛酸。
5、优选地，在上述非程序无血清冻存液中，渗透性保护剂包括二甲基亚砜(dmso)、还原型谷胱甘肽(gsh)、谷丙二肽和丙酮酸钠。
6、优选地，在上述非程序无血清冻存液中，溶剂为ph7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(pbs)、dmem培养基、mem培养基中的一种。
7、更为优选地，在上述非程序无血清冻存液中，由羧甲基海藻糖、l-脯氨酸、vc、硫辛酸、羟乙基淀粉、dmso、gsh、谷丙二肽、丙酮酸钠和溶剂组成。其中，羧甲基海藻糖的含量为3-7％质量体积比(w/v)，l-脯氨酸的含量为3-6％w/v，vc的含量为0.1-0.4mm，硫辛酸的含量为1-3mm，羟乙基淀粉的含量为3-6％w/v，dmso的含量为5-10％体积比(v/v)，gsh的含量为0.1-0.4％w/v，谷丙二肽的含量为2-4mm，丙酮酸钠的含量为1-3mm。
8、本专利技术第二方面提供了上述非程序无血清冻存液在细胞低温保存中的应用。
9、优选地，在上述应用中，细胞为哺乳动物细胞，具体包括vero、hela、hek-293t、thp-1、hct-15、bhk-21、h9、c8 d1a、a673、ball-1、a9、emt6、ins-1、sk-n-as、mh-s、sp2/0、293f、cho-k1(贴壁)、cho-k1(悬浮)、pc-12、c6、raw264.7、h22、a549、bv2、sf9、hepg2、mcf-7、sh-sy5y、大鼠bmsc、大鼠肺成纤维、大鼠脐带干等各类细胞。
10、优选地，在上述应用中，具体方法为：将除去培养基的细胞加至冻存液中，混匀成细胞悬液后转移至-80℃下直接冻存。
11、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
12、本专利技术在冻存液中创新性地引入了羧甲基海藻糖，羧甲基海藻糖是在海藻糖的碳6位羟基位置引入羧甲基基团后形成的一种新型的多功能活性分子。羧甲基海藻糖相比于细胞冻存中常用的海藻糖具有更好的吸水和持水性能，在快速降温过程中可更快的降低胞内水分，减少胞内胞外冰晶的形成，能够有效减少冻存过程中水分子晶体结构对细胞膜的机械损伤；为了避免快速失水和降温过程中积累的活性氧自由基对胞内蛋白及胞膜的损伤，添加了vc和硫辛酸作为抗氧化保护剂；同时，由于高浓度vc和硫辛酸对细胞存在一定毒性，故添加了相应比例的l-脯氨酸进行中和，而且脯氨酸可以维持细胞膜的稳定，为细胞提供营养；辅以渗透性保护剂dmso、gsh、谷丙二肽和丙酮酸钠等物质，可有效地维持细胞在冻存过程中细胞膜的完整和生理活力的维持。
13、本专利技术的非程序无血清冻存液不含血清、动物源成分，且无需耗时的程序冷冻保存步骤，可避免冻存过程中的细胞损伤，有效维持冻存复苏后细胞活力和增殖能力。
14、本专利技术的非程序无血清冻存液适用范围广泛，对现有常用的各类哺乳动物细胞均具有很好的保存效果。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种非程序无血清冻存液，其特征在于，包括羧甲基海藻糖、抗氧化保护剂、L-脯氨酸、渗透性保护剂和溶剂。
2.根据权利要求1所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，所述抗氧化保护剂包括VC和硫辛酸组成。
3.根据权利要求1或2所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，所述渗透性保护剂包括DMSO、GSH、谷丙二肽和丙酮酸钠。
4.根据权利要求3所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，所述溶剂为PBS、DMEM、MEM中的一种。
5.根据权利要求3所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，由羧甲基海藻糖、L-脯氨酸、VC、硫辛酸、羟乙基淀粉、DMSO、GSH、谷丙二肽、丙酮酸钠和溶剂组成。
6.根据权利要求5所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，由3-7％w/v羧甲基海藻糖、3-6％w/v L-脯氨酸、0.1-0.4mM VC、1-3mM硫辛酸、3-6％w/v羟乙基淀粉、5-10％v/vDMSO、0.1-0.4％w/v GSH、2-4mM谷丙二肽、1-3mM丙酮酸钠和溶剂组成。
7.根据权利要求6所述的非程序无血清冻存液，
8.如权利要求1-7任一项所述的非程序无血清冻存液在细胞低温保存中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞为哺乳动物细胞。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将细胞加入冻存液中，混匀成细胞悬液后转移至-80℃下直接冻存。
...【技术特征摘要】
1.一种非程序无血清冻存液，其特征在于，包括羧甲基海藻糖、抗氧化保护剂、l-脯氨酸、渗透性保护剂和溶剂。
2.根据权利要求1所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，所述抗氧化保护剂包括vc和硫辛酸组成。
3.根据权利要求1或2所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，所述渗透性保护剂包括dmso、gsh、谷丙二肽和丙酮酸钠。
4.根据权利要求3所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，所述溶剂为pbs、dmem、mem中的一种。
5.根据权利要求3所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，由羧甲基海藻糖、l-脯氨酸、vc、硫辛酸、羟乙基淀粉、dmso、gsh、谷丙二肽、丙酮酸钠和溶剂组成。
6.根据权利要求5所述的非程序无血清冻存液，其特征在于，由3-7％w/v羧甲基海藻糖、3-6％w/v...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴亭，刘浩，刘娟，
申请(专利权)人：武汉普诺赛生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。