【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种外泌体冻存保护液及制备方法。
技术介绍
1、外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30-150nm，具有脂质双层膜结构，携带rna和蛋白质，被大多数细胞类型释放，是细胞间通讯系统的一部分。
2、几乎所有的细胞都会分泌外泌体，包括间充质干细胞。间充质干细胞分泌的外泌体含有与母细胞相似的成分，如细胞因子、生长因子、脂类、mrnas及调控型mirnas等，并参与细胞与细胞间的交流通讯及改变组织的微环境等，如促进血管再生，抑制细胞凋亡及纤维化，进而促进损伤组织修复再生。越来越多的研究表明，间充质干细胞来源的外泌体可减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等，并在组织损伤修复和器官功能恢复过程中起着非常重要的作用，因此，间充质干细胞分泌的外泌体有望取代细胞治疗，成为一种安全有效的无细胞治疗药剂。
3、外泌体的稳定性低、容易失活，为了维持外泌体的结构完整性必须在相对低温下维持和运送这类制剂以便维持其生物活性。对于冷冻保存的外泌体，主要的挑战之一便是防止结构性和功能性成分在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。然而，超低温保存的时间过长、在使用过程中反复冻融或者使用不当，往往都会使得外泌体的生物活性迅速大幅下降，这限制了它的正常使用。
4、通常，制备好的外泌体以液体形式存在，并使用pbs（英文名称：phosphatebuffered saline；中文名称：磷酸缓冲盐溶液）或培养基或牛血清等作为溶剂保存在-20℃的低温环境中，使用前需要解冻。当
5、因此亟需一种成分简单、能在较低温下长期保存外泌体且不影响其活性的冻存保护试剂及方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种外泌体冻存保护液及制备方法，以解决现有保存液冻存下的外泌体活性差的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、本专利技术提供一种外泌体冻存保护液，该保护液的制备原料包括：pbs、gags糖链、聚乙二醇6000、人血清白蛋白和丙二醇（英文名称：dimethyl sulfoxide；中文名称：二甲基亚砜）。
4、其中，pbs为常用的缓冲液。gags糖链是由重复的双糖单元组成的无分枝的多糖链，是一种存在于细胞表面和细胞外基质中的生物大分子，其可以防止外泌体间的互相黏连及成团，提高外泌体的存活率。丙二醇为小分子物质，可渗透到外泌体的内部，对外泌体进行保护；同时，外泌体内部的水分也不会过分外渗，避免了外泌体过分脱水皱缩，提高外泌体的存活率。聚乙二醇6000属于大分子物质，其可降低冰点，减少冰晶的形成；同时，由于聚乙二醇6000的分子量大，这使得溶液中电解质浓度降低，从而减轻对溶质的损伤。人血清白蛋白可以增加溶液的黏性，降低外泌体在冻存液中的缓冲力，提高存活率。
5、较为优选的，本申请中的gags糖链是透明质酸（英文名称：hyaluronic acid；简称：ha）、硫酸乙酰肝素（英文名称：heparan sulfate；简称：hs）、肝素（英文名称：heparin）、硫酸软骨素（英文名称：chondroitin sulfate；简称：cs）、硫酸皮肤素（英文名称：dermatansulfate；简称：ds）和硫酸角质素（英文名称：keratan sulfate；简称：ks）中的任意一种。
6、较为优选的，本申请中的gags糖链的序列为cxpxr，其中x为脯氨酸除外的任何氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等。
7、按照质量分数，本专利技术提供的外泌体冻存保护液的制备原料包括：50-60%pbs、15-20%gags糖链、8-12%聚乙二醇6000、5-10%人血清白蛋白和3-8%丙二醇。较为优选的，本专利技术提供的外泌体冻存保护液的制备原料包括：50%pbs、20%糖链、12%聚乙二醇6000、10%人血清白蛋白和8%丙二醇。
8、本申请还提供一种外泌体冻存保护液的制备方法，该方法包括：将gags糖链、聚乙二醇6000、人血清白蛋白、丙二醇加入到pbs中，混合均匀得到外泌体冻存保护液。
9、进一步，各组分混合之前，分别采用滤膜进行过滤处理。过滤处理后的gags糖链、聚乙二醇6000、人血清白蛋白和丙二醇加入到pbs中。本申请中的滤膜采用滤孔直径为0.2-0.3μm的滤膜。较为优选的，滤膜的滤孔直径为0.22μm。
10、本专利技术具有以下有益效果：
11、本专利技术提供了一种外泌体冻存保护液及制备方法，该保护液的制备原料包括：pbs、gags糖链、聚乙二醇6000、人血清白蛋白和丙二醇。gags糖链是一种存在于细胞表面和细胞外基质中的生物大分子，其可以防止外泌体间的互相黏连及成团，提高外泌体的存活率。丙二醇为小分子物质，可渗透到外泌体内部，对外泌体进行保护；同时，外泌体内部的水分也不会过分外渗，避免了外泌体过分脱水皱缩，提高外泌体的存活率。聚乙二醇6000属于大分子物质，其可降低冰点，减少冰晶的形成；同时，由于聚乙二醇6000的分子量大，这使得溶液中电解质浓度降低，从而减轻对溶质的损伤。人血清白蛋白可以增加溶液的黏性，降低外泌体在冻存液中的缓冲力，提高存活率。该冻存保护液能够使外泌体在-20℃的低温条件下稳定保存6个月，并维持外泌体的蛋白含量，保持外泌体活性。本申请提供的冻存保护液的成分简单、组成明确、配比合理，且原料价格便宜、易获取，具有低成本优势，适合工业化生产。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种外泌体冻存保护液，其特征在于，所述保护液的制备原料包括：PBS、GAGs糖链、聚乙二醇6000、人血清白蛋白和丙二醇。
2.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述保护液的制备原料按照质量分数包括：50-60%PBS、15-20%GAGs糖链、8-12%聚乙二醇6000、5-10%人血清白蛋白和3-8%丙二醇。
3.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述保护液的制备原料按照质量分数包括：50%PBS、20%GAGs糖链、12%聚乙二醇6000、10%人血清白蛋白和8%丙二醇。
4.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述GAGs糖链为透明质酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述GAGs糖链的序列为CXPXR，其中X为脯氨酸除外的任何氨基酸。
6.一种外泌体冻存保护液的制备方法，其特征在于，包括：将GAGs糖链、聚乙二醇6000、人血清白蛋白、丙二醇加入到PBS中，混合均匀得到外
7.根据权利要求6所述的外泌体冻存保护液的制备方法，其特征在于，所述GAGs糖链、所述聚乙二醇6000、所述人血清白蛋白、所述丙二醇通过滤膜过滤后加入到所述PBS中。
8.根据权利要求7所述的外泌体冻存保护液的制备方法，其特征在于，所述滤膜的滤孔直径为0.2-0.3μm。
9.根据权利要求7或8所述的外泌体冻存保护液的制备方法，其特征在于，所述滤膜的滤孔直径为0.22μm。
...【技术特征摘要】
1.一种外泌体冻存保护液，其特征在于，所述保护液的制备原料包括：pbs、gags糖链、聚乙二醇6000、人血清白蛋白和丙二醇。
2.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述保护液的制备原料按照质量分数包括：50-60%pbs、15-20%gags糖链、8-12%聚乙二醇6000、5-10%人血清白蛋白和3-8%丙二醇。
3.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述保护液的制备原料按照质量分数包括：50%pbs、20%gags糖链、12%聚乙二醇6000、10%人血清白蛋白和8%丙二醇。
4.根据权利要求1所述的外泌体冻存保护液，其特征在于，所述gags糖链为透明质酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素中的任意一种。
【专利技术属性】
技术研发人员：徐哲，李栋，戴晓宇，赵莎莎，
申请(专利权)人：济南万泉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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