【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，更具体地说，涉及一种基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法。
技术介绍
1、马尾松(pinus massoniana lamb.)是松科松属树种，我国特有种，为多年生常绿乔木，在苏、皖、浙、湘、赣、闽、云贵及两广地区皆有分布。马尾松长势快、产脂量高、干形通直且耐干旱贫瘠，是我国南方地区重要的材用、脂用和生态树种。据第九次全国森林资源清查统计(《中国森林资源报告(2014-2018)，2019)，我国马尾松人工林面积超过250万公顷(占4.41％)，其蓄积达1.876亿立方米，占全国人工乔木林蓄积的5.54％，全国天然马尾松林超过550万公顷，其蓄积达4.384亿立方。因此，马尾松在维护国家生态安全与保障木材战略储备中占据着重要地位。抗性育种可以从根本上防治松材线虫病，为松材线虫病防治提供了新思路。然而，传统育种方法周期长、见效慢、很难在短期内培育出抗性良种。
2、生物育种手段可以弥补传统手段的不足，加速育种进程。但由于马尾松基因组巨大、杂合度高，缺乏遗传转化系统，阻碍了基因编辑和转基因新种质创制等生物育种研究的步伐。目前以离体再生和遗传转化为基础的现代生物技术手段可以将外源基因导入马尾松基因组并使之稳定遗传，产生定向变异，实现大幅度遗传改良，缩短育种周期，但是现有研究多以成熟合子胚等外植体为受体，转化率低，无法解决马尾松高效遗传转化的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于马尾松胚性愈伤组织
2、为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：
3、一种基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，将预培养5～10d的马尾松胚性愈伤组织作为遗传转化受体，利用根癌农杆菌介导将目的基因转入胚性愈伤组织中进行遗传转化，在遗传转化后对胚性愈伤组织进行共培养，除菌后经过筛选培养，获得抗性愈伤组织。
4、作为优选，所述预培养包括将马尾松胚性愈伤组织接种至液体增殖培养基中进行振荡暗培养，获得转化受体；液体增殖培养基包括以下浓度的组分：kno3 909.9mg/l、ca(no3)2·4h2o 236.2mg/l、nh4no3 200.0mg/l、kh2po4 136.1mg/l、mgso4·7h2o 246.5mg/l、mg(no3)2·6h2o 256.5mg/l、mgcl2·6h2o 101.7mg/l、h3bo3 15.5mg/l、znso4·7h2o14.668mg/l、mnso4·h2o 10.5mg/l、na2moo4·2h2o 0.125mg/l、ki 4.15mg/l、cuso4·5h2o0.1725mg/l、cocl2·6h2o 0.125mg/l、feso4·7h2o 13.93mg/l、edta-na2 18.65mg/l、glycine 2.0mg/l、nicotinic acid 0.5mg/l、thiamine hcl 1.0mg/l、tocopherol 0.5mg/l、6-ba 0.5～1.0mg/l、kt 0.5～1.0mg/l、naa 0.5～1.0mg/l、、蔗糖30g/l、肌醇0.5g/l、谷氨酰胺0.5g/l、水解酪蛋白0.45g/l。
5、作为优选，所述暗培养温度为22±1℃，摇床转速为100～120rpm，时间为5～8d。
6、作为优选，所述遗传转化包括利用根癌农杆菌侵染液侵染胚性愈伤组织；根癌农杆菌侵染液的制备过程为：挑取含有目的基因表达载体的根癌农杆菌单菌落转移至添加抗生素的lb液体培养基中倒置暗培养，挑取单菌落，接种于含有相同抗生素的5ml lb液体培养基中摇菌过夜，按1:50比例吸取培养液置于新的lb液体培养基中，培养6～8h至od600＝0.6～0.8，离心，利用添加乙酰丁香酮的液体增殖培养基重悬菌体，获得根癌农杆菌侵染液。
7、作为优选，所述侵染时间为10～20min，所述重悬菌体至侵染液od600＝0.1～0.3。更优选，所述重悬菌体至侵染液od600＝0.3。
8、作为优选，所述根癌农杆菌选自agl、lba4404中的一种或几种。
9、作为优选，所述倒置暗培养的温度为28℃，所述添加乙酰丁香酮浓度为50～100μm，所述抗生素包括kan和rif，所述lb液体培养基中，kan的浓度均为50mg/l，rif的浓度均为50mg/l。
10、作为优选，所述lb液体培养基的配方为：10g/l胰蛋白胨+5g/l酵母提取物+10g/lnacl，ph为7.2。
11、作为优选，所述共培养包括将侵染后的遗传转化受体抽滤后置于共培养培养基上进行共培养；共培养培养基包括以下浓度的组分：kno3 909.9mg/l、ca(no3)2·4h2o236.2mg/l、nh4no3 200.0mg/l、kh2po4 136.1mg/l、mgso4·7h2o 246.5mg/l、mg(no3)2·6h2o256.5mg/l、mgcl2·6h2o 101.7mg/l、h3bo3 15.5mg/l、znso4·7h2o 14.668mg/l、mnso4·h2o10.5mg/l、na2moo4·2h2o 0.125mg/l、ki 4.15mg/l、cuso4·5h2o 0.1725mg/l、cocl2·6h2o0.125mg/l、feso4·7h2o 13.93mg/l、edta-na2 18.65mg/l、glycine 2.0mg/l、nicotinic acid 0.5mg/l、thiamine hcl 1.0mg/l、tocopherol 0.5mg/l、6-ba 0.5～1.0mg/l、kt 0.5～1.0mg/l、naa0.5～1.0mg/l、、蔗糖30g/l、肌醇0.5g/l、谷氨酰胺0.5g/l、水解酪蛋白0.45g/l、结冷胶4g/l、乙酰丁香酮50～100μm、头孢霉素300mg/l、特美汀100mg/l。
12、作为优选，所述共培养温度为22±1℃，暗培养2～3d。
13、作为优选，所述除菌包括将共培养后的胚性愈伤组织用含有抗生素的无菌水清洗2次后，对脱菌后的胚性愈伤组织进行抽滤，除去水分后置于筛选培养基上进行筛选培养；无菌水为含有300mg/l特美汀和300mg/l头孢霉素的无菌水，脱菌时间为10～20min；
14、所述筛选包括在筛选培养基中连续筛选培养3次，每次筛选培养的时间为20d；筛选培养基包括以下浓度的组分：kno3 909.9mg/l、ca(no3)2·4h2o 236.2mg/l、nh4no3200.0mg/l、kh2po4 136.1mg/l、mgso4·7h2o 246.5mg/l、mg(no3)2·6h2o 256.5mg/l、mgcl2·6h2o 101.7mg/l、h3bo3 15.5mg/l、znso4·7h2o 14.668mg/l、mnso4·h2o 10.5mg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，将预培养5～10d的马尾松胚性愈伤组织作为遗传转化受体，利用根癌农杆菌介导将目的基因转入胚性愈伤组织中进行遗传转化，在遗传转化后对胚性愈伤组织进行共培养，除菌后经过筛选培养，获得抗性愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述预培养包括将马尾松胚性愈伤组织接种至液体增殖培养基中进行振荡暗培养，获得转化受体；液体增殖培养基包括以下浓度的组分：KNO3 909.9mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 236.2mg/L、NH4NO3 200.0mg/L、KH2PO4 136.1mg/L、MgSO4·7H2O 246.5mg/L、Mg(NO3)2·6H2O 256.5mg/L、MgCl2·6H2O 101.7mg/L、H3BO3 15.5mg/L、ZnSO4·7H2O 14.668mg/L、MnSO4·H2O 10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、KI 4.15mg/L、CuSO4·5H2O 0.1725mg/L、CoCl2·6H2O0.125m
3.根据权利要求2所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述暗培养温度为22±1℃，摇床转速为100～120rpm，时间为5～8d。
4.根据权利要求1所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化包括利用根癌农杆菌侵染液侵染胚性愈伤组织；根癌农杆菌侵染液的制备过程为：挑取含有目的基因表达载体的根癌农杆菌单菌落转移至添加抗生素的LB液体培养基中倒置暗培养，挑取单菌落，接种于含有相同抗生素的5mL LB液体培养基中摇菌过夜，按1:50比例吸取培养液置于新的LB液体培养基中，培养6～8h至OD600＝0.6～0.8，离心，利用添加乙酰丁香酮的液体增殖培养基重悬菌体，获得根癌农杆菌侵染液。
5.根据权利要求4所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述侵染时间为10～20min，所述重悬菌体至侵染液OD600＝0.1～0.3。
6.根据权利要求1所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述根癌农杆菌选自AGL、LBA4404中的一种或几种。
7.根据权利要求4所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述倒置暗培养的温度为28℃，所述添加乙酰丁香酮浓度为50～100μM，所述抗生素包括Kan和Rif，所述LB液体培养基中，Kan的浓度均为50mg/L，Rif的浓度均为50mg/L。
8.根据权利要求1所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述共培养包括将侵染后的遗传转化受体抽滤后置于共培养培养基上进行共培养；共培养培养基包括以下浓度的组分：KNO3 909.9mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 236.2mg/L、NH4NO3 200.0mg/L、KH2PO4 136.1mg/L、MgSO4·7H2O 246.5mg/L、Mg(NO3)2·6H2O 256.5mg/L、MgCl2·6H2O101.7mg/L、H3BO3 15.5mg/L、ZnSO4·7H2O 14.668mg/L、MnSO4·H2O 10.5mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L、KI 4.15mg/L、CuSO4·5H2O 0.1725mg/L、CoCl2·6H2O 0.125mg/L、FeSO4·7H2O 13.93mg/L、EDTA-Na2 18.65mg/L、Glycine 2.0mg/L、Nicotinic acid 0.5mg/L、Thiamine HCl 1.0mg/L、Tocopherol 0.5mg/L、6-BA0.5～1.0mg/L、KT 0.5～1.0mg/L、NAA0.5～1.0mg/L、、蔗糖30g/L、肌醇0.5g/L、谷氨酰胺0.5g/L、水解酪蛋白0.45g/L、结冷胶4g/L、乙酰丁香酮50～100μM、头孢霉素300mg/L、特美汀100mg/L。
9.根据权利要求1所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述共培养...
【技术特征摘要】
1.一种基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，将预培养5～10d的马尾松胚性愈伤组织作为遗传转化受体，利用根癌农杆菌介导将目的基因转入胚性愈伤组织中进行遗传转化，在遗传转化后对胚性愈伤组织进行共培养，除菌后经过筛选培养，获得抗性愈伤组织。
2.根据权利要求1所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述预培养包括将马尾松胚性愈伤组织接种至液体增殖培养基中进行振荡暗培养，获得转化受体；液体增殖培养基包括以下浓度的组分：kno3 909.9mg/l、ca(no3)2·4h2o 236.2mg/l、nh4no3 200.0mg/l、kh2po4 136.1mg/l、mgso4·7h2o 246.5mg/l、mg(no3)2·6h2o 256.5mg/l、mgcl2·6h2o 101.7mg/l、h3bo3 15.5mg/l、znso4·7h2o 14.668mg/l、mnso4·h2o 10.5mg/l、na2moo4·2h2o 0.125mg/l、ki 4.15mg/l、cuso4·5h2o 0.1725mg/l、cocl2·6h2o0.125mg/l、feso4·7h2o 13.93mg/l、edta-na2 18.65mg/l、glycine 2.0mg/l、nicotinicacid 0.5mg/l、thiamine hcl 1.0mg/l、tocopherol 0.5mg/l、6-ba 0.5～1.0mg/l、kt 0.5～1.0mg/l、naa0.5～1.0mg/l、、蔗糖30g/l、肌醇0.5g/l、谷氨酰胺0.5g/l、水解酪蛋白0.45g/l。
3.根据权利要求2所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述暗培养温度为22±1℃，摇床转速为100～120rpm，时间为5～8d。
4.根据权利要求1所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述遗传转化包括利用根癌农杆菌侵染液侵染胚性愈伤组织；根癌农杆菌侵染液的制备过程为：挑取含有目的基因表达载体的根癌农杆菌单菌落转移至添加抗生素的lb液体培养基中倒置暗培养，挑取单菌落，接种于含有相同抗生素的5ml lb液体培养基中摇菌过夜，按1:50比例吸取培养液置于新的lb液体培养基中，培养6～8h至od600＝0.6～0.8，离心，利用添加乙酰丁香酮的液体增殖培养基重悬菌体，获得根癌农杆菌侵染液。
5.根据权利要求4所述的基于马尾松胚性愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于，所述侵染时间为1...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨春霞，邓诏磊，刘倩，胡珊，涂忠华，杜强，谷振军，周光，丁伟，
申请(专利权)人：江西省林业科学院，
类型：发明
国别省市：
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