【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种基于多重pcr检测外源基因定点整合效率的方法，例如通过常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(crispr/cas)或其介导的同源重组进行的外源基因定点整合。
技术介绍
1、crispr/cas系统是一种基因编辑技术，可以利用特异性的核酸酶在基因组的特定位置切割dna，造成dna双链的断裂，进而通过细胞的修复机制实现基因的敲入、敲除、替换或点突变。
2、基因敲入是一种基因编辑的方法，指的是将外源dna片段精确地插入到目标基因的内部，这一过程通常需要借助同源重组的途径和一段与目标基因具有高度同源性的dna修复模板。使用crispr cas系统对特定位点进行编辑，通过hdr将外源dna模板精确地整合进入细胞基因组中并实现稳定的表达，这一特性可在细胞治疗领域得到广泛的应用。
3、然而，目前对于外源片段在基因组上的整合效率检测并没有迅速且精确的检测手段。根据文献的报道，一般对基因敲入(knock-in)效率的检测方法是通过挑选单克隆，对挑选的单克隆细胞的目的位点进行测序，进而得到knock-in的效率，这种检测方法显然不适合在细胞治疗中使用的原代细胞。synthego[1]开发了ice analysis方法，通过sanger测序得到的峰图，可以对knock-in效率进行检测，而该方法只适用于300nt以内的片段knock-in，对更长片段的插入的检测则无能为力。daniel[2]使用了数字pcr技术对大片段的嵌合性抗原受体(car)的knock-in效率进
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是现有技术缺乏对长片段外源基因(例如car基因)敲入效率进行有效检测的缺陷，提供一种基于多重pcr检测外源基因定点整合效率的方法。本专利技术的方法可解决上述所列举出来的对定点整合比例检测的缺点，利用高保真的dna聚合酶进行多重pcr反应，可以实现对更长片段的knockin的检测；同时，不需要构建dna文库，利用普通pcr仪器引入校正系数，也可以实现对细胞中外源基因knockin比例的定量检测。
2、本领域技术人员知晓，当利用同源重组的方式将外源基因片段敲入目的位点时，目的位点的dna片段长度便会有相应的增加，因此，在使用引物扩增目的位点处的片段时，发生敲入的目的位点将有更长的dna长度。基于这一现象，专利技术人基于多重pcr重新设计，在检测过程中一共使用3条引物，其中一条引物序列位于目的位点之外，一条引物序列位于敲入的外源基因片段上，另一条引物序列位于目的位点内部。使用这三条引物进行多重pcr反应时，理论上最后可以获得3类pcr扩增产物：
3、1、未发生敲入的目的位点的扩增产物；
4、2、发生了外源片段敲入的目的位点的包含部分外源片段的扩增产物；
5、3、发生了外源片段敲入的目的位点的包含全部外源片段的扩增产物。
6、由于第3类扩增片段一般长度较长，因此可通过调整pcr的延伸时间使该片段无法扩增进而仅得到1、2两类扩增产物。
7、而在pcr的样品上样量保持一致的情况下，样品中发生敲入的比例越高，则第1类扩增产物的量会越少，第2类扩增产物的量会越多。因此不同扩增产物的质量/浓度比例即可反应出样品中外源片段敲入比例。
8、扩增产物的质量/浓度比例可通过多种方式获得，常用的如琼脂糖凝胶电泳后的灰度分析，也可使用agilent公司的生物分析仪进行检测。
9、而对于多重pcr反应，不同引物对的pcr扩增效率亦会有所区别，因此专利技术人进一步引入了包含第1类和第2类扩增产物片段的标准品，通过混合出不同比例的标准品混合物，再经过扩增产物质量/浓度比例的计算，可以绘制出标准曲线，得到相应的曲线公式，将样品的结果带入公式中，即可计算出准确的外源片段敲入比例。在后续实验中，专利技术人同样测试了使用pcr扩增片段按比例混合获得标准曲线的方法，经证明，使用pcr扩增产物同样可以满足需求。
10、本专利技术通过以下技术方案解决上述技术问题。
11、本专利技术的第一方面提供一种基于多重pcr检测样品中外源基因或其片段敲入效率的方法，所述方法包括：
12、使用引物组合对样品中的脱氧核糖核酸进行pcr获得pcr产物，并对所述pcr产物的浓度比例进行标准曲线定量；
13、所述引物组合包括靶向外源基因或其片段的正向引物1、正向引物2和反向引物；
14、其中，所述正向引物1的5’端位于外源基因或其片段在核酸中的敲入位点对应的上游序列中，所述正向引物2的5’端位于外源基因或其片段对应的序列中，所述反向引物的5’端位于外源基因或其片段在核酸中的敲入位点对应的下游序列中；
15、所述pcr产物包括pcr产物1和pcr产物2，所述pcr产物1由所述正向引物1与反向引物扩增得到，所述pcr产物2由所述正向引物2与反向引物扩增得到；
16、所述外源基因或其片段的敲入效率＝pcr产物2的浓度/(pcr产物2的浓度+pcr产物1的浓度)。
17、本专利技术中，所述敲入是指将外源基因或其片段定点(site-directed)整合至目标位点，“敲入效率”可与“定点整合效率”互换使用。
18、本专利技术一些实施方案中，所述pcr反应中，所述正向引物1与正向引物2等比例混合；所述正向引物1与正向引物2的总摩尔量与反向引物的摩尔量之比为1:1。
19、本专利技术一些实施方案中，所述引物组合中的引物长度为18-30bp，优选为18-27bp、18-25bp或18-20bp。
20、本专利技术一些实施方案中，所述正向引物1的5’端距离敲入位点至少200nt、至少500nt、至少800nt、至少1000nt或至少为1200nt。
21、本专利技术一些实施方案中，所述反向引物的5’端距离敲入位点至少500nt、至少800nt、至少1000nt或至少为1200nt。
22、本专利技术一些实施方案中，所述标准曲线定量通过电泳实现；所述电泳例如为琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳。
23、本专利技术一些实施方案中，所述外源基因或其片段的长度至少为50bp、至少为100bp、至少为200bp、至少为500bp、至少为800bp、至少为1000bp、至少为1200bp、至少为1500bp、至少为1800bp或至少为2000bp。
24、本专利技术一些实施方案中，所述外源基因或其片段的长度至少为500bp、至少为800bp、至少为1000bp、至少为1200bp、至少为1500bp、至少为1800bp或至少为2000bp。
25、本专利技术一些实施方案中，所述外源基因或其片段为编码嵌合抗原受体的脱氧核糖核酸。
26、本专利技术一些实施方案本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于多重PCR检测样品中外源基因或其片段敲入效率的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应中，所述正向引物1与正向引物2等比例混合；所述正向引物1与正向引物2的总摩尔量与反向引物的摩尔量之比为1:1；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标准曲线定量通过电泳实现；
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸的序列包含GSH位点或编码蛋白的基因，所述敲入的位点位于所述GSH位点或所述基因内；
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，当所述GSH位点为AAVS1位点时，所述正向引物1包含如SEQ ID NO:4所示的序列，所述反向引物包含SEQ ID NO:5所示的序列；
6.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括靶向外源基因或其片段的正向引物1、正向引物2和反向引物；所述正向引物1的5’端位于外源基因或其片段在核酸中的敲入位点对应的上游序列中，所述正向引物2的5’端位于外源基因或其片段对应的序列中，所述反向引物的5’端位于
7.一种PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包含如权利要求6所述的引物组合。
8.一种PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求7所述的PCR反应体系；
9.一种基于多重PCR检测外源基因或其片段敲入效率的系统，其特征在于，所述系统包括PCR反应装置、核酸定量及分析装置；
10.一种扩增外源基因或其片段的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求6所述的引物组合、如权利要求7所述的PCR反应体系或者如权利要求8所述的PCR试剂盒对外源基因或其片段进行PCR扩增的步骤；
11.一种如权利要求6所述的引物组合、如权利要求7所述的PCR反应体系、如权利要求8所述的PCR试剂盒或者如权利要求9所述的系统在检测外源基因或其片段敲入效率中的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种基于多重pcr检测样品中外源基因或其片段敲入效率的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pcr反应中，所述正向引物1与正向引物2等比例混合；所述正向引物1与正向引物2的总摩尔量与反向引物的摩尔量之比为1:1；
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标准曲线定量通过电泳实现；
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述脱氧核糖核酸的序列包含gsh位点或编码蛋白的基因，所述敲入的位点位于所述gsh位点或所述基因内；
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，当所述gsh位点为aavs1位点时，所述正向引物1包含如seq id no:4所示的序列，所述反向引物包含seq id no:5所示的序列；
6.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括靶向外源基因或其片段的正向引物1、正向引物2和反向引物；所述正向引物1的5’端位于外源基因或其片段在核酸中的敲入位点对应的上游序列中，所述正向引物2的5’端位于外源基因...
【专利技术属性】
技术研发人员：舒望琴，唐若淞，张楫钦，刘明耀，郑彪，
申请(专利权)人：上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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