【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种重组蛋白内毒素的去除方法。
技术介绍
1、在生物制药领域中，利用细胞培养技术生产的重组蛋白在医疗卫生事业中发挥着至关重要的作用。细胞培养液经过表达、澄清过滤、纯化及制剂的无菌分装、冻干等操作，制得重组蛋白。
2、内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏细胞后才释放出来，且内毒素结构复杂，可以与溶液中的蛋白质结合形成复合物，增加了去除难度。然而，即使极微量的内毒素也会引起人体不良反应，轻则发热，重则休克，由于这些不良反应，必须从药物、注射剂和其他生物和药品中去除内毒素。
3、去除内毒素的一些常用技术包括超滤法、亲和吸附法、相分离法、离子交换色谱法。虽然，这些方法能够去除部分内毒素，但是，单独使用一种方法去除内毒素存在去除率低的弊端，难以达到动物可以耐受的水平的有效方法。
4、因此，有必要设计一种高效的技术方案克服上述缺陷，控制产品内毒素含量，保证患者安全。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供了以下的技术方案：
2、本专利技术第一方面提供了一种重组蛋白内毒素的去除方法，所述去除方法包括：
3、1)收集细胞蛋白表达液，浓缩；
4、2)对步骤1)中的细胞蛋白表达浓缩液进行亲和层析；
5、3)对步骤2)亲和层析的产物进行triton x-114处理。
6、进一步，所述步骤2)中亲和层析的操作包括：通过f
7、进一步，所述细胞蛋白表达浓缩液的上样浓度为35mg/毫升柱体积。
8、进一步，所述细胞蛋白表达浓缩液的上样体积为5ml。
9、进一步，所述细胞包括昆虫细胞、原核细胞、酵母、哺乳动物细胞、植物、禽类细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞及无细胞系统。
10、进一步，所述细胞包括cho细胞、hek293细胞。
11、进一步，所述cho细胞包括cho-dxb11、cho-k1、cho-dg44、cho-s。
12、术语“细胞”包括植物和动物细胞，并且包括无脊椎动物、非哺乳类脊椎动物和哺乳动物细胞。以上细胞均包括细胞群体及后代。示例性非哺乳类脊椎动物细胞包括，例如，禽类细胞、爬行动物细胞和两栖动物细胞。示例性无脊椎动物细胞包括但不限于昆虫细胞，例如蠋(草地贪夜蛾)细胞、蚊(埃及伊蚊)细胞、果蝇(黑腹果蝇)细胞。细胞可以为分化、部分分化或未分化的，例如干细胞，包括胚胎干细胞和多能干细胞。来源于器官或器官系统的额外的组织样品可以根据本专利技术使用。示例性哺乳动物细胞包括，例如，来源于人，非人灵长类，猫，狗，绵羊，山羊，奶牛，马，猪，兔，包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠在内的啮齿类的细胞，以及其任何衍生物和后代。
13、术语“cho细胞”(chinese hamster ovary cells)是一种来源于中国仓鼠卵巢细胞的实验室培养细胞系。这种细胞系因其广泛的生物学特性和在分子生物学研究中的应用而闻名。具体来说，cho细胞是一个上皮样细胞，通常贴壁生长，也可以悬浮生长。它们被广泛应用于表达重组dna的蛋白质，包括疫苗生产。
14、进一步，所述步骤3)中triton x-114处理的具体操作包括：向步骤2)亲和层析的产物添加triton x-114，4℃搅拌孵育，室温孵育，离心，取上清，得到内毒素去除的重组蛋白。
15、术语“亲和层析”指一种层析模式，其中待分开的靶分子通过其与分子(例如根据本专利技术的包含重组蛋白和内毒素的溶液)的相互作用进行分离，所述分子与靶分子特异性相互作用。
16、进一步，所述添加triton x-114的终浓度为1％。
17、进一步，所述4℃搅拌孵育的时间为25-35min。
18、在一些实施方案中，所述4℃搅拌孵育的时间为25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min。
19、进一步，所述室温孵育的时间为15-25min。
20、在一些实施方案中，所述室温孵育的时间为15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min。
21、进一步，所述离心的时间为15min，温度为18-26℃，转速为13000×g。
22、在一些实施方案中，所述离心的温度为18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃。
23、进一步，所述fc平衡缓冲液组分为：20mm tris，0.15m nacl，6m hcl。
24、进一步，所述fc淋洗液1组分为：50mm柠檬酸钠，1m nacl，6m hcl。
25、进一步，所述fc淋洗液2组分为：50mm柠檬酸钠，6m hcl。
26、进一步，所述fc洗脱缓冲液组分为：0.1m glycine，0.15m nacl，25mm谷氨酰胺，12％海藻糖以及6m hcl。
27、在一个具体的实施方案中，所述重组蛋白内毒素的去除方法包括如下步骤：收集细胞蛋白表达液，浓缩；通过fc洗脱缓冲液冲洗3倍柱体积，之后通过fc平衡缓冲液冲洗层析柱至uv280nm和电导率稳定，将蛋白表达浓缩液以35mg/毫升柱体积上样5ml至层析柱，之后再通过fc平衡缓冲液冲洗层析柱至uv280nm回归基线，之后依次通过fc淋洗液1、fc淋洗液2以及fc洗脱缓冲液洗脱，uv280nm≥10mau时开始收集，uv280nm≥10mau时结束收集；添加终浓度为1％的triton x-114到收集液中，在4℃下孵育25～35分钟，并进行搅拌。在室温下继续孵育15～25分钟，之后在18～26℃条件下以13000×g转速离心15分钟，取上清，得到去除内毒素的重组蛋白。
28、术语“重组蛋白”特别地是指通过重组dna技术制备的蛋白质，其中通常将编码表达蛋白质的dna插入合适的表达载体中，所述载体进而用于转化或在病毒载体的情形下感染宿主细胞以制备异源蛋白。因此，如本文所用术语“重组蛋白”特别是指从重组dna分子表达的蛋白质分子。用于制备重组蛋白的合适系统包括(但不限于)昆虫细胞(例如杆状病毒)、原核系统(例如大肠杆菌)、酵母(例如酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母)、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢，hek293)、植物(例如红花)、禽类细胞、两栖动物细胞、鱼类细胞及无细胞系统(例如兔网织红血球裂解物)。
29、本专利技术第本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于，所述去除方法包括：
2.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于，所述步骤2)中亲和层析的操作包括：通过FC洗脱缓冲液冲洗3倍柱体积，然后通过FC平衡缓冲液冲洗层析柱至UV280nm和电导率稳定，将收集到的细胞蛋白表达浓缩液上样到层析柱，再通过FC平衡缓冲液冲洗层析柱至UV280nm回归基线，之后依次通过FC淋洗液1、FC淋洗液2以及FC洗脱缓冲液洗脱，UV280nm≥10mAU时开始收集，UV280nm≥10mAU时结束收集；
3.根据权利要求2所述的去除方法，其特征在于，所述FC平衡缓冲液组分为：20mMTris，0.15M NaCl，6M HCl；
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-3任一项所述的去除方法中使用的试剂。
5.一种低内毒素的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白由权利要求1-3任一项所述的去除方法制备而成。
6.一种内毒素去除试剂盒，其特征在于，所述内毒素去除试剂盒包括权利要求4所述的组合物，和容器；
7.权利要求1-3任一项所
8.一种系统或装置，其特征在于，所述系统或装置包括储存有权利要求1-3任一项所述的去除方法的计算机存储介质；
9.权利要求1-3任一项所述的去除方法，权利要求4所述的组合物，权利要求6所述的内毒素去除试剂盒在制备低内毒素水平、高蛋白水平的疫苗中的应用。
10.权利要求1-3任一项所述的去除方法，权利要求4所述的组合物，权利要求6所述的内毒素去除试剂盒在降低含内毒素的重组蛋白药物对受试者的不良反应中的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白内毒素的去除方法，其特征在于，所述去除方法包括：
2.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于，所述步骤2)中亲和层析的操作包括：通过fc洗脱缓冲液冲洗3倍柱体积，然后通过fc平衡缓冲液冲洗层析柱至uv280nm和电导率稳定，将收集到的细胞蛋白表达浓缩液上样到层析柱，再通过fc平衡缓冲液冲洗层析柱至uv280nm回归基线，之后依次通过fc淋洗液1、fc淋洗液2以及fc洗脱缓冲液洗脱，uv280nm≥10mau时开始收集，uv280nm≥10mau时结束收集；
3.根据权利要求2所述的去除方法，其特征在于，所述fc平衡缓冲液组分为：20mmtris，0.15m nacl，6m hcl；
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1-3任一项所述的去除方法中使用的试剂。
5.一种低内毒素的...
【专利技术属性】
技术研发人员：闫博宇，孙爽，徐榕，杨露，王康健，
申请(专利权)人：北京同立海源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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