本发明专利技术涉及从山羊肌肉细胞分离的编码Ｓ６Ｋ２蛋白的ｃＤＮＡ的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。本发明专利技术通过比对已知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ序列（ＧｅｎＢａｎｋ登陆号ＸＭ－５８２４７８）设计出了一对用于ＲＴ－ＰＣＲ扩增羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ编码区片段的引物并用这对引物通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了特异性片段，测序后得到了羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的编码区的４７９ｂｐ的核苷酸序列和与它的前４７７ｂｐ对应的氨基酸序列。获得的这４７７ｂｐ的核苷酸序列可进一步用于羊Ｓ６Ｋ２基因全长ｃＤＮＡ的克隆及用于通过ＲＴ－ＰＣＲ或杂交的方法检测Ｓ６Ｋ２基因的组织表达特异性，也可用于重组表达得到蛋白后制备检测Ｓ６Ｋ２的抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从山羊肌肉细胞分离的编码S6K2蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码S6K2蛋白质 的cDNA编码区477bp的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。
技术介绍
细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条 件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它剌激生长的因子存在时，细胞通过生物大分子合 成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。尽管目前对细胞生长和细胞周期分裂是如何协调的 机制理解的还很少，但信号蛋白T0R (target of rapamycin)在从酵母到果蝇直至哺乳动物细胞中作为细 胞生长的中心协调器的作用已为人们所认识，这一在进化上保守的协调器调节着基本的生物加工过程。最 具特色的mT0R下游效应器包括两条信号通路，即4E-BP1 (真核细胞翻译启始因子4E (elF4E)结合蛋白1) 和S6Ks (核糖体蛋白S6激酶)，形成了两条平行的调节niRNA转译的信号通路。哺乳动物细胞中有两种S6Ks蛋白，即S6K1和S6K2，它们分别由两个基因所编码。两种蛋白在组成、 结构和功能等方面都是相近的。S6K2是一个属于AGO激酶家族的Ser/Thr激酶。S6K2蛋白包含了 5个主 要的结构域，自N端始分另ij为NT (N-terminal domain), catalytic domain, the linker region, autoinhibitory domain和CT(C-terminal domain)。 S6K2有两种形态，分别称为S6K2卩1 (p70pl)和S6K邻2 (p70卩2)。人 的S6K2 e 1含有495个氨基酸残基，S6K2 P 2含有482个氨基酸残基，二者仅在N端相差13个氨基酸并且 在S6K2Pl多出的13个氨基酸中包含了核定位信号。编码p703和p70a的基因核苷酸序列的同源性为70%, 而氨基酸序列同源性为85%，进一步的结构分析表明，在S6K2的C端也有核定位信号，故S6K2的两种形 态都是核型的。实验证明S6K2在小鼠细胞生长和胚胎发育中起着重要的作用，S6K2影响着蛋白的合成和 细胞的生长。迄今，关于S6K2在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在人、鼠、牛等哺乳动物的细 胞中开展并取得了许多成果，但尚未见有关山羊细胞中S6K2的研究报道，也未见有山羊S6K2基因的cDNA 核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。在各种情况下，有重要的原因研究和开发与山羊S6K2蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究 清楚山羊的S6K2基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的 质量等方面，由重组S6K2蛋白制备的抗体可以检测S6K2基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个 体的不同发育阶段的表达情况
技术实现思路
本专利技术人己经努力从山羊的不同组织细胞中分离S6K2基因。作为结果，本专利技术人从山羊肌肉 组织细胞分离了 S6K2基因的cDNA编码区479bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由它的前477bp推断 出的氨基酸序列。本专利技术人通过比对己知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的S6K2基因的核苷酸序列，找 到保守区，然后根据牛的S6K2基因(XM-582478)cDNA编码区的序列，设计出了一对用于通过RT-PCR方 法扩增山羊S6K2基因cDNA编码区片段的简并引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引 物扩增出了特异性片段，测序后得到了山羊S6K2基因的cDNA编码区479bp片段，序列分析表明与牛的序 列(XM-582478)同源性为98%(470/479),推导出的由此序列编码的氨基酸序列与牛的相比有3个氨基酸 的差别。这一cDNA片段称为"gS6K2"。所以，本专利技术的目的是通过己知的不同物种的S6K2的核苷酸序列设计简并引物，然后通过RT-PCR方 法克隆山羊S6K2基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码山羊S6K2蛋白的基因的cDNA的编 码区477bp的核苷酸序列和由此推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。附图的简要说明从下面给出的说明结合附图，本专利技术的上面目的的特征将变的明了。其中附图说明图1显示了牛S6K2基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号XM-582478)。图2显示了 477 bp的山羊S6K2基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO: 1 )和由此推断的氨基酸 序列(SEQ ID NO: 2)。图3是显示从山羊肌肉组织分离的总RNA的RT-PCR的结果(479 bp的cDNA gS6K2)的电泳图。 图4是显示以质粒PMD19-T-gS6K2为模板，以Pl、 P2为引物进行PCR鉴定的电泳图。图5是显示将质粒pMD19-T-gS6K2进行酶切鉴定的电泳图。图6显示了山羊S6K2基因cDNA的编码区核苷酸序列与牛(XM-582478)的S6K2基因cDNA的序列的比 较。具体实施方式为了从山羊组织细胞中分离S6K2基因，本专利技术人首先按照提取RNA的标准要求采集内蒙 古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat, Cspra力/rcws )的各类组织样本。艮卩，现场宰杀内蒙古 白绒山羊后立即采取肌肉、肝、肾、淋巴结、脾及睾丸等组织块(将组织块大小控制在30 50ug)，放入 冷冻管后立即入液氮保存，带回实验室后置于-8(TC冰箱保存备用。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒 (TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取山羊肌肉组织、睾丸组织、肾组织、肝组 织、淋巴结组织及脾脏组织的总RNA，最后根据文献报道的哺乳动物S6K2基因在各类组织中的表达情况 和总RNA提取结果，选定以肌肉组织总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第_ 链为模板，利用特异性引物P1、 P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回 收，测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-gS6K2。为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-gS6K2，将其转化f co乃'DH5 a感受态细胞，然后将 此被质粒pMD19-T- gS6K2转化了的DH5 a细胞涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行 蓝、白菌落筛选。37'C培养16小时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步 认定白色菌落为获得的重组菌落。重组菌落和重组质粒pMD19-T-gS6K2的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先挑取划线培养的菌落用 Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物Pl、 P2进行PCR鉴定，阳性的初步认定为重组质粒， 其相应的齒落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提 的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒进一步进行单酶切和￡coi I /历wdll双酶切鉴定。经过 了 PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质粒pMD19-T-gS6K2。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质 粒和重组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-本文档来自技高网...
【技术保护点】
独立权利要求 本专利技术涉及一段从山羊肌肉细胞分离的编码Ｓ６Ｋ２蛋白的ｃＤＮＡ，更具体地说涉及编码Ｓ６Ｋ２蛋白质的ｃＤＮＡ编码区核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。目前应用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆基因并获得相应的核苷酸序列是获得基因（ｃＤＮＡ） 核苷酸序列的常用方法。本项专利技术设计了一对引物并应用这对引物通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了山羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的编码区特异性片段，经过测序后得到这一片段的４７９ｂｐ的核苷酸序列，其特征是在还没有羊Ｓ６Ｋ２基因核苷酸序列的情况下，通过比较已知的狗、猴、牛、人、大鼠、小鼠的Ｓ６Ｋ２基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ序列设计ＰＣＲ引物，进而通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了山羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ的编码区片段，测序后得到了４７９ｂｐ的核苷酸序列和与它的前４７７ｂｐ对应的氨基酸序列，这一山羊Ｓ６Ｋ２基因ｃＤＮＡ编码区片段的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列在国内外是首次获得。 基于上述说明的本专利技术的技术特征，本专利技术的独立权利要求表述为：一种自山羊分离的多核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列，是下列序 列之一：１）序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的４７７ｂｐ的ｃＤＮＡ序列；２）与序列表中ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的ｃＤＮＡ序列对应的标注为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的氨基酸序列。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王志钢，刘东军，旭日干，
申请(专利权)人：王志钢，刘东军，旭日干，
类型：发明
国别省市：15[中国|内蒙]
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