【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因载体，尤其是涉及聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用。
技术介绍
1、聚乙烯亚胺(pei)是一种由单体链(-ch2ch2nh-)构成的水溶性高电荷阳离子聚合物。由于pei具有转染效率高，成本低廉，操作简便等特点，被视为基因转染的“金标准”，已成为基因治疗、dna疫苗等领域中研究最广泛的非病毒基因递送载体之一。[参见l.wang,d.wu,h.xu,y.you.high dna-binding affinity and gene-transfection efficacy ofbioreducible cationic nanomicelles with a fluorinated core,angewandte chemieinternational edition.2016,55,755-759.]。一般认为分子量20000以上的pei具有较为满意的转染效率，但随着pei分子量的提高细胞毒性也随之增大。除此之外，不可降解性一直制约着pei这种优异基因递送载体的临床应用，可降解的pei的开发对于推动pei类材料的临床转化具有重大意义。
2、目前常用的策略是对超支化或者线性pei进行化学改性，连接上酯键、二硫键和碳氮双键等具有可生物降解的化学结构，或者使用聚乙二醇(peg)、透明质酸(ha)和聚氨基酸等对pei进行修饰和遮蔽，以提高pei的生物相容性，降低毒性。除此之外，在pei上引入与dna/细胞膜之间具有多重相互作用的化学基团也可以达到降低细胞毒性，提高转染效率的目的。[参见h.fang,z.guo
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种聚乙烯亚胺衍生物，本专利技术提供的聚乙烯亚胺衍生物可以作为基因载体，兼具低毒高效和可降解的特点。
2、本专利技术提供了一种聚乙烯亚胺衍生物，包括由氧化剂对聚乙烯亚胺进行氧化反应，得到。
3、本专利技术所述氧化剂选自高锰酸钾、重铬酸钾、过氧化氢或硫酸氢钾中的一种或几种；
4、所述聚乙烯亚胺的重均分子量为300～1000000da；更优选为800～35000da。
5、本专利技术所述氧化剂和聚乙烯亚胺重复单元的物质的量比为0.01～1：1；
6、当氧化剂为过氧化氢时，过氧化氢与聚乙烯亚胺重复单元的物质的量比为0.05～0.6；更优选为0.05～0.55；最优选为0.05～0.53。
7、本专利技术还提供了聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，包括如下步骤：
8、a)聚乙烯亚胺、溶剂和氧化剂混合反应，得到混合液；
9、b)将混合离心、沉降，产物采用水溶解，冻干，即得。
10、本专利技术提供的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法首先聚乙烯亚胺、溶剂和氧化剂混合反应，得到混合液。所述溶剂为甲醇。
11、在其中一个实施例中，聚乙烯亚胺和甲醇混合，超声使其分散，加入氧化剂，涡旋震荡。
12、其中聚乙烯亚胺和甲醇的质量体积比为25mg：600～700μl；
13、所述超声的时间为3～10min。更优选为5min～10min。反应温度为20～37℃，更优选为25～37℃。反应的时间为2h。
14、将上步反应结束后的液体倒入容器中，加入9～11倍体积的冰乙醚沉降，离心沉降出产物，倒掉上层多余的乙醚。优选的，将上步反应结束后的液体倒入容器中，加入10倍体积的冰乙醚沉降，离心沉降出产物，倒掉上层多余的乙醚。所述离心的转速为6000rpm～10000rpm；更优选为8000rpm～10000rpm。
15、在通风橱中将装有产物的离心管开盖放置3h，使残余的乙醚挥发。
16、采用超纯水将产物溶解，冻干，即得。所述冻干参数为-30℃～-80℃。
17、本专利技术提供了上述所述的聚乙烯亚胺衍生物、或上述所述的制备方法制备得到的聚乙烯亚胺衍生物在制备基因载体中的应用。
18、本专利技术所述基因载体的用途包括基因递送、基因转染和基因治疗。
19、可以选用的基因包括各种报告基因、抗癌基因、细胞因子基因等在真核细胞中重组表达的质粒dna。
20、本专利技术提供了一种基因载体，包括上述技术方案任意一项所述的聚乙烯亚胺衍生物、或上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到的聚乙烯亚胺衍生物。
21、在一个实施例中，以绿色荧光蛋白表达质粒为例；复合比例为载体材料与pegfp的质量比为5～80:1；可以为5/1、10/1、20/1、40/1和80/1。
22、上述基因载体的制备方法为本领域技术人员熟知的其余方法，本专利技术对此不进行限定。
23、本专利技术提供了一种转染试剂，包括上述技术方案所述的基因载体和核酸。
24、上述转染试剂还包括溶剂，所述溶剂包括但不限于超纯水或本领域技术人员熟知的缓冲液。
25、本专利技术所述转染试剂的制备方法包括：将基因载体和核酸混合，孵育，即得。所述孵育的条件优选为室温，10～20min；更优选为室温，15min。本专利技术所述室温可以为15～35℃。
26、本专利技术提供了一种基因转染方法，采用上述的转染试剂进行转染。
27、所述转染包括将细胞与所述转染试剂接触，培养；所述培养时间为1～3d；优选为40～50h。
28、在一个实施例中，本专利技术所述转染方法可以为：按照0.2μg pdna/孔的用量将载基因纳米颗粒加入到96孔细胞板中，继续培养48h。具体参见实施例43。
29、转染效率的测定：
30、从培养箱中取出96孔细胞培养板，用胰酶对待测孔中的细胞进行消化，离心收集细胞，再用pbs重悬待测细胞，使用流式细胞仪对细胞的egfp表达阳性率进行测定，以评估不同载体材料的转染效率。
31、本专利技术提供了可降解的聚乙烯亚胺衍生物基因载体的制备方法及应用，该聚乙烯亚胺衍生物通过氧化剂对pei进行氧化反应得到。此外，本专利技术通过改变氧化剂的反应投料量，并基于不同分子量的pei制备得到多种氧化程度不同的聚乙烯亚胺衍生物(oxpei)。通过体外dna转染实验，筛选出氧化程度为20-30％的oxpei1.8k-2和氧化程度为10-20％的oxpei22k-1具有最优的dna转染效率。通过对细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，包括由氧化剂对聚乙烯亚胺进行氧化反应，得到。
2.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述氧化剂选自高锰酸钾、重铬酸钾、过氧化氢或硫酸氢钾中的一种或几种；
3.一种1～2任意一项所述的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A)所述溶剂为甲醇；所述超声的时间为3～10min；所述反应的温度为20～37℃，反应的时间为2h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤B)所述离心的转速为6000rpm～10000rpm；
6.权利要求1～2任意一项所述的聚乙烯亚胺衍生物、或权利要求3～5任意一项所述的制备方法制备得到的聚乙烯亚胺衍生物在制备基因载体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因载体的用途包括基因递送、基因转染和基因治疗。
8.一种基因载体，其特征在于，包括权利要求1～2任意一项所述的聚乙烯亚胺衍生物、或权利要求3～5任意一项所述的制备方法制备得
9.一种转染试剂，其特征在于，包括权利要求8所述的基因载体和核酸。
10.一种基因转染方法，其特征在于，采用权利要求9的转染试剂进行转染。
...【技术特征摘要】
1.一种聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，包括由氧化剂对聚乙烯亚胺进行氧化反应，得到。
2.根据权利要求1所述的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，所述氧化剂选自高锰酸钾、重铬酸钾、过氧化氢或硫酸氢钾中的一种或几种；
3.一种1～2任意一项所述的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述溶剂为甲醇；所述超声的时间为3～10min；所述反应的温度为20～37℃，反应的时间为2h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤b)所述离心的转速为6000rpm～10000r...
【专利技术属性】
技术研发人员：田华雨，杨志宇，郭晓雅，郝凯，方华攀，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：
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