【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种杜氏肌营养不良症猴模型的构建方法及其用途。
技术介绍
1、杜氏肌营养不良症(dmd)是一种进行性的、致死性的肌肉萎缩遗传疾病，由位于x染色体的dmd基因突变引起。患者通常在3～4岁发病，10岁左右瘫痪，20～30岁死于心肺功能衰竭，目前尚无有效的治疗方法。dmd的动物模型多为小鼠模型，但小鼠与人类无论在遗传背景、生理病理、解剖结构和免疫反应方面均存在显著差异，这导致基于小鼠模型的基因治疗方法和药物开发很难转化应用到人上。而非人灵长类(non-human primates,nhps)动物在遗传基因、行为、生殖生理、解剖结构和功能、代谢以及复杂的免疫系统等方面与人类具有高度的相似性。因此，建立nhps疾病动物模型，并以此模型探究基因治疗的有效性和安全性，能够加快临床转化的速度，对人类遗传疾病的治疗及研究具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题在于提供一种杜氏肌营养不良症(dmd)猴模型的构建方法及其用途，所构建的动物模型是研究dmd及其治疗方法和药物的理想载体。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了一种针对猕猴dmd基因50号外显子设计的sgrna；
3、所述sgrna为exon50-sgrna1，exon50-sgrna2，exon50-sgrna3，exon50-sgrna4，exon50-sgrna5中的一种；
4、exon50-sgrna1是针对猴dmd基因50号外显子设计的sgrna，核
5、exon50-sgrna2是针对猴dmd基因50号外显子设计的sgrna，核苷酸序列为：atacttacaggctccaacag(seq id no.2)。
6、exon50-sgrna3是针对猴dmd基因50号外显子设计的sgrna，核苷酸序列为：aagcagcctgacctagctcc(seq id no.3)。
7、exon50-sgrna4是针对猴dmd基因50号外显子设计的sgrna，核苷酸序列为：gctccaacagtggtcagtcc(seq id no.4)。
8、exon50-sgrna5是针对猴dmd基因50号外显子设计的sgrna，核苷酸序列为：gtcagtccaggagctaggtc(seq id no.5)。
9、进一步的，所述猴dmd基因为猕猴dmd基因或食蟹猴dnd基因。
10、基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种dmd猴模型的构建方法，包括以下步骤：
11、(1)合成上述针对猕猴dmd基因50号外显子设计的sgrna的mrna，合成spcas9的mrna；
12、(2)将所述spcas9的mrna和所述sgrna的mrna进行混合得到混合物；将所述混合物注射入猴受精卵中；
13、(3)将注射后的受精卵移植到孕母猴子宫中，获得杜氏肌营养不良症猴模型。
14、上述的构建方法，进一步的，所述混合物由spcas9的mrna和sgrna的mrna混合物用无菌水稀释混合得到；sgrna的浓度为100ng/μl，spcas9的浓度为50ng/μl。
15、上述的构建方法，进一步的，所述sgrna的mrna采用以下方法合成：
16、s1-1、根据所述sgrna的序列合成体外转录的引物对；
17、s1-2、将所述正义链引物和反义链引物进行体外转录得到sgrna的mrna。
18、所述exon50-sgrna1包括exon50-sgrna1-f和exon50-sgrna1-r；所述exon50-sgrna1-f的dna序列如seq id no.6所示，所述exon50-sgrna1-r的dna序列如seq id no.7所示。
19、所述exon50-sgrna2包括exon50-sgrna2-f和exon50-sgrna2-r；所述exon50-sgrna2-f的dna序列如seq id no.8所示，所述exon50-sgrna2-r的dna序列如seq id no.9所示。
20、所述exon50-sgrna3包括exon50-sgrna3-f和exon50-sgrna3-r；所述exon50-sgrna3-f的dna序列如seq id no.10所示，所述exon50-sgrna3-r的dna序列如seq idno.11所示。
21、所述exon50-sgrna4包括exon50-sgrna4-f和exon50-sgrna4-r；所述exon50-sgrna4-f的dna序列如seq id no.12所示，所述exon50-sgrna4-r的dna序列如seq idno.13所示。
22、所述exon50-sgrna5包括exon50-sgrna5-f和exon50-sgrna5-r；所述exon50-sgrna5-f的dna序列如seq id no.14所示，所述exon50-sgrna5-r的dna序列如seq idno.15所示。
23、基于一个总的技术构思，本专利技术还提供了一种针对猕猴dmd基因50号外显子设计的sgrna在制备dmd药物中的用途。
24、与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
25、(1)本专利技术提供了一种高效的、靶向dmd基因50号外显子的sgrna，通过优化注射剂量，从而使f0代就能够获得纯合突变的dmd模型猴。与之前需要3～4年，猴性成熟后才能通过辅助生殖技术进行繁殖从而获得模型猴相比，应用本专利技术的构建方法，只需一年就能获得dmd模型猴，大大减少了时间成本，能够在较短时间内获得理想的非人灵长类动物模型。本专利技术对于探索dmd的致病机制、监测发病进程、开发及评价治疗的新方法或药物的有效性和安全性等有着重大的意义。
26、(2)本专利技术提供了一种dmd猴模型的构建方法，该构建方法构建的动物模型可控性高、重复性好，所得的模型猴能够更好的模拟dmd患者的临床特点，因此是研究dmd发病机制及治疗的理想动物模型。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种杜氏肌营养不良症猴模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA为Exon50-sgRNA1，Exon50-sgRNA2，Exon50-sgRNA3，Exon50-sgRNA4，Exon50-sgRNA5中的一种；
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述混合物由sgRNA的mRNA和spCas9的mRNA用无菌水稀释得到，所述sgRNA的浓度为100ng/μl，所述spCas9的浓度为50ng/μl。
4.一种权利要求1至3中任一项所述的构建方法得到的动物模型在制备DMD药物中的用途。
【技术特征摘要】
1.一种杜氏肌营养不良症猴模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna为exon50-sgrna1，exon50-sgrna2，exon50-sgrna3，exon50-sgrna4，exon50-sgrna5中的一种；
【专利技术属性】
技术研发人员：陈永昌，白绕仙，张婷，郭文婷，肖浦豪，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。