【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种提高大肠杆菌总rna产量的蛋白rna纳米复合物及其应用。
技术介绍
1、rna是一种具有多功能的生物大分子，可以广义地定义为编码rna(mrna)和非编码rna(ncrna)。ncrna有多种类型，包括trna、lncrna、mirna、小干扰rna(sirna)、sa rna、circrna、和外泌体rna等多种类型。
2、随着mrna新冠疫苗的成功开发以及多种基于rna的新型药物获批，rna已跃居药物研究前沿。不同类型的rna具有多种功能，并在细胞和组织中发挥着重要的调节作用。细胞中mrna可以翻译产生治疗性蛋白来替代有缺陷或缺失的蛋白；mrna也可作为反义寡核苷酸(aso)、sirna、mirna、适配体和抑制性trna的治疗靶点。sirna通过与mrna编码区的特定序列结合，导致mrna的降解。这种靶向特异性增加了其作为潜在药物的可能性。aso识别并结合互补的dna或rna序列，它可以促进正常的mrna剪接，防止功能失常蛋白的表达，或者靶向降解rna。适配体是构成特定三维结构的寡核苷酸序列。适配体可以结合广泛的靶标，包括蛋白质、细胞、微生物、化合物和其他核酸。它与蛋白的结合可以抑制蛋白之间的相互作用，从而产生治疗效果。
3、rna疗法具有几方面的重要优势，包括对靶标具有高度特异性，通过替换rna的序列可以进行模块化的开发，在药代动力学和药效学方面的可预测性，以及相对安全(它们中的大多数不会改变基因组)。然而复杂的原料供应链以及高昂的生产成本从一定程度限制了rna的广泛应
技术实现思路
1、针对目前体外转录底物价格昂贵的问题，本专利技术经过方法技术改进，通过在大肠杆菌e.coli ht115(de3)中表达一种蛋白rna纳米复合物以显著增加其总rna的产量，然后经rnase a降解成核苷混合物作为体外转录反应的底物，同时利用大肠杆菌重组菌株生产t7rna聚合酶，解决了常规体外转录成本高的问题，可经济高效地规模化生产rna产品。
2、因此，本专利技术通过在大肠杆菌e.coli ht115(de3)中表达一种蛋白rna纳米复合物，可以显著增加大肠杆菌中的总rna的量。通过提取大肠杆菌的rna并利用rnase a将其降解成核苷混合物(strezsak,steven r.,penny j.beuning,and nicholas j.skizim."complete enzy matic digestion of double-stranded rna to nucleosides enablesaccurate quantification of dsrna."analytical methods 13.2(2021):179-185.)，该核苷混合物在t7rna聚合酶作用下，以目标dna为模板生产形成目标rna。该体系有以下特点：1)通过在大肠杆菌e.coli ht115(de3)中表达蛋白rna复合物可以显著增加其总rna的量。提取得到的总rna经过rna酶降解得到经济廉价的核苷酸混合物，可作为体外转录底物，替代昂贵的核苷酸：atp/utp/ctp/gtp；2)该体系反应用的聚合酶由大肠杆菌生产，制备简单，产量高，能有效催化rna的生成，降低生产成本。
3、本专利技术采用的技术方案如下：
4、本专利技术提供一种提高大肠杆菌总rna产量的蛋白rna纳米复合物，其包括两部分通过重组表达自组装而成：蛋白部分含有荧光蛋白mcherry及在其n端和c端融合的可与tar适配体特异性结合的多肽deg；rna部分包括gc含量为45～65％长度为70-120nt的rna序列(优选地gc含量为51％的长度为100nt)的两端分别连接tar适配体而成。
5、优选地，tar适配体的序列为cgcucguugagcucauuagcuccgagcg；gc含量为51％的rna序列为accgaagggacuaugugucuccaccucuugccuucaauggcguuacgcgguaaaguggc ccuguucaccggacgcguccugaguuguauuaccuucagcccaagccuaccaaccccccag；
6、优选地，所述rna部分的核苷酸如seq id no:4所示；
7、所述蛋白部分的氨基酸序列如seq id no:2所示。
8、本专利技术提供一种制备所述的蛋白rna纳米复合物的方法，其是培养导入了含有编码所述蛋白部分和rna部分的表达质粒的重组菌而得到蛋白rna纳米复合物；
9、所述重组菌是大肠杆菌。
10、具体地，所述蛋白部分的编码核苷酸序列基于大肠杆菌表达偏好进行了密码子优化，具体如seq id no:3所示，所述rna部分的编码核苷酸序列基于大肠杆菌表达偏好进行了密码子优化，具体如seq id no:6所示。
11、优选地，所述表达质粒是共表达所述蛋白部分和rna部分的共表达质粒；优选地，出发质粒为prsf-duet-1质粒。
12、具体地，得到蛋白rna纳米复合物的步骤操作如下：
13、s1培养所述重组菌后离心收集细胞；细胞破碎后低速离心去除细胞碎片后收集上清，上清离心后得沉淀用缓冲液重悬；
14、s2与适量的磁珠混合后置于摇床孵育后用磁力架分离磁珠；
15、s3后用适量含有咪唑的缓冲液进行洗脱得到蛋白rna纳米复合物。
16、本专利技术还提供一种制备重组菌的总rna的方法，其包括培养导入了含有编码所述蛋白部分和rna部分的表达质粒的重组菌，进而收集其总rna的步骤；
17、所述重组菌是大肠杆菌。
18、具体地，收集总rna的步骤操作如下：
19、s1培养所述重组菌后离心收集细胞；
20、s2用适量的rnase-free的缓冲液重悬并加入相同体积的饱和酚溶液，充分涡旋后离心；
21、s3将水相转移至新的容器进行乙醇沉淀得到总rna沉淀，任选地，用rnase-free水溶后得到总rna。
22、本专利技术提供一种无细胞体外转录反应体系，其含所述方法制备得到总rna的降解物作为核苷酸混合物。
23、具体地，所述降解是采用rnase a进行酶解。
24、本专利技术通过表达一种理性设计的蛋白rna纳米复合物显著提高大肠杆菌中总rna的产量，而后经酶解得到低成本的核苷酸混合物。生产时利用大肠杆菌来生产核苷酸底物，dna模板以及t7rna聚合酶，通过体外转录反应生产得到目标rna产品，大大降低rna的生产成本。这种生产方式具有效率高，成本低，过程可控的优点；有望带来巨大的经济效益。
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1.一种提高大肠杆菌总RNA产量的蛋白RNA纳米复合物，其特征在于，其包括两部分通过重组表达自组装而成：蛋白部分含有荧光蛋白mCherry及在其N端和C端融合的可与TAR适配体特异性结合的多肽Deg；RNA部分包括GC含量为45~65%长度为70-120nt的RNA序列(优选地GC含量为51%的长度为100nt)的两端分别连接TAR适配体而成。
2.如权利要求1所述的蛋白RNA纳米复合物，其特征在于，TAR适配体的序列为CGCUCGUUGAGCUCAUUAGCUCCGAGCG；GC含量为51%的RNA序列为ACCGAAGGGACUAUGUGUCUCCACCUCUUGCCUUCAAUGGCGUUACGCGGUAAAGUGGCCCUGUUCACCGGACGCGUCCUGAGUUGUAUUACCUUCAGCCCAAGCCUACCAACCCCCCAG；
3.一种制备如权利要求1或2所述的蛋白RNA纳米复合物的方法，其特征在于，培养导入了含有编码所述蛋白部分和RNA部分核苷酸序列的表达质粒的重组菌而得到蛋白RNA纳米复合物；
4.如权利要求3所述的方法，
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表达质粒是共表达所述蛋白部分和RNA部分的共表达质粒；优选地，出发质粒为pRSF-Duet-1质粒。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，得到蛋白RNA纳米复合物的步骤操作如下：
7.一种制备重组菌的总RNA的方法，其特征在于，包括培养导入了含有编码所述蛋白部分和RNA部分的表达质粒的重组菌，进而收集其总RNA的步骤；
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，收集总RNA的步骤操作如下：
9.一种无细胞体外转录反应体系，其特征在于，其含有如权利要求7和8所述的方法制备得到总RNA的降解物得到的核苷酸混合物作为体外转录反应的底物。
10.如权利要求9所述的无细胞体外转录反应体系，其特征在于，所述降解是采用RNaseA进行酶解。
...【技术特征摘要】
1.一种提高大肠杆菌总rna产量的蛋白rna纳米复合物，其特征在于，其包括两部分通过重组表达自组装而成：蛋白部分含有荧光蛋白mcherry及在其n端和c端融合的可与tar适配体特异性结合的多肽deg；rna部分包括gc含量为45~65%长度为70-120nt的rna序列(优选地gc含量为51%的长度为100nt)的两端分别连接tar适配体而成。
2.如权利要求1所述的蛋白rna纳米复合物，其特征在于，tar适配体的序列为cgcucguugagcucauuagcuccgagcg；gc含量为51%的rna序列为accgaagggacuaugugucuccaccucuugccuucaauggcguuacgcgguaaaguggcccuguucaccggacgcguccugaguuguauuaccuucagcccaagccuaccaaccccccag；
3.一种制备如权利要求1或2所述的蛋白rna纳米复合物的方法，其特征在于，培养导入了含有编码所述蛋白部分和rna部分核苷酸序列的表达质粒的重组菌而得到蛋白rna纳米复合物；
4.如权利要求3...
【专利技术属性】
技术研发人员：何利中，邹宗胜，陈自银，
申请(专利权)人：百葵锐深圳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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