选择性R-钙黏着蛋白拮抗剂和方法技术

一种用作哺乳动物Ｒ－钙黏着蛋白选择性拮抗剂的分离肽包含３－３０个氨基酸残基，该肽的３个连续残基具有氨基酸序列Ｉｌｅ－Ｘａａ－Ｓｅｒ；其中Ｘａａ是选自Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ和Ｇｌｎ的氨基酸残基。Ｘａａ优选是Ａｓｐ或Ａｓｎ。在一个优选实施方案中，该肽是具有３－１０个环形排列的氨基酸残基的环形肽。本发明专利技术的选择性Ｒ－钙黏着蛋白拮抗肽用于抑制干细胞例如内皮前体细胞靶向发育中的脉管系统，用于抑制Ｒ－钙黏着蛋白介导的细胞粘附并用于抑制视网膜血管形成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】选择性R-钙黏着蛋白拮抗剂和方法                 相关申请的相互参照本申请要求2003年5月1日提交的专利序号60/467,188的美国临时申请的权益，其通过引用结合在本文中。                   政府利益声明本专利技术受美国政府支持，在国立卫生研究院拨款号EY11254和EY12598下进行。美国政府在本专利技术中享有某些权利。                     专利
本专利技术总的来说涉及哺乳动物细胞粘附分子拮抗剂。更具体地说，本专利技术涉及哺乳动物R-钙黏着蛋白(钙黏着蛋白-4)的选择性肽拮抗剂和抑制细胞粘附及随其产生的视网膜血管形成的方法。                     专利技术背景钙黏着蛋白家族的分子由跨膜糖蛋白组成，在依赖钙的选择性细胞-细胞间相互作用中发挥功能。通过介导细胞识别和细胞分选，钙黏着蛋白在胚胎发育和组织形态形成过程中发挥重要作用。钙黏着蛋白亚家族(经典钙黏着蛋白、原钙黏着蛋白、桥粒胶蛋白和其它钙黏着蛋白相关蛋白)其特征为可变数量的胞外钙黏着蛋白结构域、单个跨膜片断和单个细胞质结构域。据报道，所谓经典钙黏着蛋白(例如E、P、N和R-钙黏着蛋白)具有5个参与嗜同性相互作用的串联重复胞外钙黏着蛋白结构域(EC1-EC5)，以及高度保守的介导粘附特异性胞内信号的胞质尾区。当多个表达在相邻细胞上的钙黏着蛋白分子相互作用时，发生-->钙黏着蛋白介导的细胞-细胞粘附，导致粘附连接的形成。根据Shapiro等提出的钙黏着蛋白拉链模型(Nature，1995，374(6520)：327-37)，同一细胞膜内的钙黏着蛋白分子形成紧密的平行链状二聚物(即所谓顺式二聚物)。如图1所示，然后这些顺式二聚物与表达在相邻细胞上的钙黏着蛋白二聚物结合(即反式二聚作用)。一旦维持了足够的相互反应，更多钙黏着蛋白分子被募集到该部位，出现钙黏着蛋白聚集，导致两细胞表面的分子交错结合。这样，相对较弱的相互作用可结合形成相当强的细胞-细胞粘附。在最初的钙黏着蛋白粘附中，由胞质钙黏着蛋白尾区与α和β联蛋白分子的相互作用传输胞内信号，导致细胞骨架重组。虽然认为与肌动蛋白纤维的结合不会影响嗜同性结合，它们的结合有助于钙黏着蛋白分子保持在相互作用的位置。在共生型关系中，钙黏着蛋白的聚集引起细胞骨架重组并提供膜连接点，这对于发生在粘附连接形成时的细胞变化很重要。与此同时，与细胞骨架的结合保持钙黏着蛋白在相互作用的位置上，并帮助募集新的钙黏着蛋白分子，因此介导了钙黏着蛋白的聚集。钙作为辅助因子在钙黏着蛋白的聚集中发挥重要作用。在钙离子浓度不足(即低于约2mM)的溶液中，钙黏着蛋白功能丧失，并且分子对蛋白酶降解更加敏感。这是由于需要钙来稳定钙黏着蛋白分子的结构并且为相邻的钙黏着蛋白接触面提供合适的定位。尽管有报道说经典钙黏着蛋白5个胞外域(EC1到EC5)中的每一个都在介导钙黏着蛋白二聚化过程中发挥重要作用，突变分析提示，形成二聚化接触面的残基中大多数发现于最N-末端的钙黏着蛋白域(EC1)内(Kitagawa，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2000；271(2)：358-63)。然而，有关钙黏着蛋白分子间特异性同源二聚的机制了解相对较少。钙黏着蛋白在神经元引导和中枢神经系统发育中发挥重要作用。据报道，钙黏着蛋白类型的差异化表达定义了大脑的不同细分-->部分。通过在发育中的视网膜的不同区域内特异性表达，钙黏着蛋白也在神经视网膜发育中发挥重要作用。例如，在胚胎鸡的视网膜发育中，有报道指出B-钙黏着蛋白仅仅发现于Muller神经胶质中，而某些双极细胞群表达R-钙黏着蛋白(也称为钙黏着蛋白-4)。无长突细胞和神经节细胞的亚群表达钙黏着蛋白6B和7。在视网膜内网层中，这些相同的钙黏着蛋白仅仅表达在与突触蛋白-I阳性神经末梢结合的亚层(sublaminae)内，提示在视网膜发育中不同的表达特征有助于在特定神经元亚群之间形成突触。在胚胎视神经中，表达R-钙黏着蛋白的神经胶质细胞与N-钙黏着蛋白的粘附介导神经节细胞轴突的突起。钙黏着蛋白粘附在发育的视网膜血管形成中也发挥重要作用(Dorrell，et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2002；43(11)：3500-10)。在表层血管丛形成过程中阻断R-钙黏着蛋白粘附导致丧失在正常血管模式中能观察到的复杂血管间互连。当在随后的深层血管层形成过程中R-钙黏着蛋白粘附被阻断时，关键指导信号丢失，导致血管迁移过正常的深层脉管丛并进入光感受器层。视网膜由明确的神经元、神经胶质和脉管部分层组成。某些疾病或病症，即使是轻微地改变视网膜层，可导致神经元退化和显著的视力丧失。作为许多导致感光细胞死亡的疾病的模型，对视网膜退化小鼠(rd/rd小鼠)的研究已超过70年。在rd/rd小鼠中，由于杆细胞经历凋亡，在出生后最初三个星期内开始光感受器退化，这是因为cGMP依赖性磷酸二酯酶的β亚基中发生突变后锥细胞光感受器死亡。rd/rd小鼠中感光细胞的死亡也暂时性伴有视网膜内血管萎缩。最初三周内3个功能层发育时脉管系统似乎以正常特征方式形成。然而，出生后第二周时深层血管层中的血管开始退化，到第四周结束时观察到显著血管退化，深层和中间血管丛几乎完全消失。造血干细胞群位于正常成年人的循环系统和骨髓中，其中不同的细胞亚群可沿阳性谱系(Lin+HSC)或阴性谱系(Lin-HSC)分化。此-->外，本专利技术人发现，Lin-HSC亚群中存在能在体内或体外形成血管的内皮前体细胞(EPC)。当EPC玻璃体内注射到小鼠眼内时，Lin-HSC群中的EPC可靶向并稳定rd/rd小鼠中退化中的脉管系统。当出生后第2天注射时，玻璃体内注射的Lin-HSC靶向表层血管层中的星形胶质细胞，并且在内源发育的血管网络形成前被发现。当内源脉管系统到达视网膜外周、即Lin-HSC靶向的部位时，该细胞结合到新的血管中，注射的Lin-HSC和内源上皮细胞的混合群形成有功能的镶嵌血管。此外，在内源上皮细胞在这些层出现血管形成之前，Lin-HSC靶向视网膜深层和中间血管层区域。与Lin-HSC的结合拯救了rd/rd小鼠的深层脉管系统，使之超出正常的和对照Lin+HSC注射小鼠约2-3倍。此外，深层脉管系统的拯救阻止了视网膜外核层中光感受器的退化。然而，因为没有证据表明这些干细胞可分化为视网膜神经元或神经胶质细胞，神经元保护的机制依然未知。在自然产生血管形成之前Lin-HSC靶向星形细胞和深层血管区，提示Lin-HSC表达在靶向中发挥功能的细胞表面分子，与发育中内源上皮细胞的靶向相似。在发育视网膜血管形成中，R-钙黏着蛋白在内皮细胞靶向星形细胞和脉管丛中发挥重要作用。在许多哺乳动物中鉴定并测序了R-钙黏着蛋白。图2描述了R-钙黏着蛋白前蛋白原人变体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，该序列由Kitagawa等作为检索号NP 001785，版本NP 001785.2，GI：14589893在SWISS-PROT数据库中报道，其有关公开通过引用结合在本文中。SEQ ID NO：1包含222-228位的氨基酸序列IDSMSGR(SEQ ID NO：2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的肽，所述肽为Ｒ－钙黏着蛋白的选择性拮抗剂，包含３－３０个氨基酸残基，所述肽的３个连续残基具有氨基酸序列Ｉｌｅ－Ｘａａ－Ｓｅｒ；其中Ｘａａ是选自Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ和Ｇｌｎ的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2003-5-1 60/467,1881.一种分离的肽，所述肽为R-钙黏着蛋白的选择性拮抗剂，包含3-30个氨基酸残基，所述肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。2.权利要求1的肽，其中Xaa是Asp或Asn。3.权利要求1的肽，其中Xaa是Asp。4.权利要求1的肽，其中Xaa是Asn。5.权利要求1的肽，其中所述肽包含至少7个氨基酸残基，所述肽的7个连续氨基酸残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)。6.权利要求5的肽，其中Xaa是Asp或Asn。7.权利要求5的肽，其中Xaa是Asp。8.权利要求5的肽，其中Xaa是Asn。9.一种分离的肽，所述肽由7个氨基酸残基组成，具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。10.一种环形肽，所述肽包含3-10个环形排列的氨基酸残基，所述环形肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。11.权利要求10的环形肽，其中Xaa是Asp或Asn。12.权利要求10的环形肽，其中Xaa是Asp。13.权利要求10的环形肽，其中Xaa是Asn。14.权利要求10的环形肽，其中所述肽包含至少7个氨基酸残基，所述肽的7个连续氨基酸残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)。15.权利要求14的环形肽，其中Xaa是Asp或Asn。16.权利要求14的环形肽，其中Xaa是Asp。-->17.权利要求14的环形肽，其中Xaa是Asn。18.权利要求10的环形肽，所述肽表示为式：其中X1和X2独立是氨基酸残基，或是由肽键连接的多个、最多10个氨基酸残基；Y1和Y2独立是氨基酸残基，彼此通过二硫键连接。19.权利要求18的环形肽，其中Y1和Y2是彼此以二硫键相连的半胱氨酸残基。20.一种分离的环形肽，所述环形肽具有氨基酸序列Cys-Ile-Xaa-Ser-Cys(SEQ ID NO：7)；其中Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基，并且所述肽在两个半胱氨酸残基之间含有二硫键。21.一种抑制视网膜血管形成的药物组合物，所述组合物包含具有3-30个氨基酸残基的分离肽和其药物可接受载体以及药物可接受的辅料，其中所述肽的3个连续残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser，Xaa是选自Asp、Asn、Glu和Gln的氨基酸残基。22.权利要求21的组合物，其中Xaa是Asp或Asn。23.权利要求21的组合物，其中Xaa是Asp。24.权利要求21的组合物，其中Xaa是Asn。25.权利要求21的组合物，其中所述肽包含至少7个氨基酸残基，所述肽的7个连续氨基酸残基具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)。26.权利要求25的组合物，其中Xaa是Asp或Asn。27.权利要求25的组合物，其中Xaa是Asp。28.权利要求25的组合物，其中Xaa是Asn。29.权利要求25的组合物，其中所述肽具有氨基酸序列Ile-Xaa-Ser-Met-Ser-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)。30.一种抑制视网膜血管形成的药物组合物，所述组合物包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：M弗里兰德，MI多雷尔，
申请(专利权)人：斯克里普斯研究学院，
类型：发明
国别省市：US[美国]