【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及流式细胞仪检测，具体涉及一种同时检测人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的试剂盒及检测方法和应用。
技术介绍
1、脓毒症是由感染引起的急危重症性疾病，以过度的炎症反应和免疫功能抑制为主要特征。尽管近年来抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，但是脓毒症的病死率仍高达70％，甚至超过了心肌梗死，是重症监护病房内非心脏病病人死亡的主要原因，严重威胁人类的生命健康。
2、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞均是炎症反应中的经典效应细胞，活化后可脱颗粒并释放多种炎症介质、脂质代谢产物和细胞因子等，同时伴随多种膜蛋白的表达变化。嗜碱性粒细胞无吞噬细菌的活性，而炎症介质诱导的活化嗜碱性粒细胞所形成的胞外陷阱具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的功能。嗜碱性粒细胞可通过增强机体对细菌感染的天然免疫应答预防脓毒症。最近的研究发现脓毒症致死患者血液嗜碱性粒细胞的数量显著减少，迟发型脓毒症早产儿出生后第一个月内血液嗜碱性粒细胞的数量和比例均显著减少，骨骼肌细胞myd88敲除的脓毒症鼠死亡率增加、腹腔嗜碱性粒细胞比例减少；此外，骨骼肌细胞il-6敲减的脓毒症鼠腹腔嗜碱性粒细胞的比例也显著减少。耗竭嗜碱性粒细胞可降低体液免疫应答并增加机体对肺炎链球菌诱导的脓毒症的易感性。此外，虽然嗜酸性粒细胞减少与脓毒症的传统生物标志物如降钙素原相比没有太多优势，但是嗜酸性粒细胞减少仍是一种诊断脓毒症的简单、方便、快速和廉价的生物标志物。更重要的是，中性粒细胞数量增加也是预测脓毒症的生物标志物。
3、目前尚未开展脓毒症患
4、cd193又称ccr3，呈组成型、稳定表达于血液嗜碱性粒细胞，也表达于嗜酸性粒细胞，然而目前尚无用cd193同时鉴定人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的报道。cd63是嗜碱性粒细胞众多胞膜分子中应用最广泛、敏感性最好的活化分子，作为一种溶酶体相关膜蛋白，静息状态下的嗜碱性粒细胞胞膜不表达cd63，但活化5min后胞膜cd63的表达上调，并与组胺的释放平行。近年来，人们对过敏患者血液嗜碱性粒细胞cd63的表达变化进行了广泛研究，但是cd63在嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的表达变化研究尤其是脓毒症患者血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的表达变化研究尚未开展。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种同时检测人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的试剂盒及检测方法和应用，本专利技术提供的试剂盒及检测方法可简单、快速地同时分析人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的比例、数量及其脱颗粒水平。
2、本专利技术提供了一种同时检测人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的试剂盒，包括如下组分：死细胞染料、fcr阻断剂、荧光标记的抗人cd63和cd193抗体、红细胞裂解液、洗涤缓冲液。
3、进一步地，所述死细胞染料为胺活性荧光染料，所述胺活性荧光染料可以透过受损细胞的胞膜而不能透过完整细胞的胞膜。
4、进一步地，所述胺活性荧光染料的荧光种类为alexa fluor 488、alexafluor594、alexa fluor 647、alexa fluor 700、apc、apc/cy7、apc/cy7、apc/h7、brilliantviolet 421、brilliant violet 510、brilliant blue 515、brilliant violet 570、brilliant violet 605、brilliant violet 650、brilliant violet 711、brilliantviolet 785、fitc、leaf、pacific blue、pe、pe/cy5、pe/cy7、pe/dazzle、percp和percp/cy5.5中的任意一种。
5、进一步地，所述抗人cd63和cd193抗体的荧光种类为alexa fluor 488、alexafluor 594、alexa fluor 647、alexa fluor 700、apc、apc/cy7、apc/cy7、apc/h7、brilliant violet 421、brilliant violet 510、brilliant blue 515、brilliant violet570、brilliant violet 605、brilliant violet 650、brilliant violet 711、brilliantviolet 785、fitc、leaf、pacific blue、pe、pe/cy5、pe/cy7、pe/dazzle、percp和percp/cy5.5中的的任意两种组合，且与胺活性荧光染料的荧光种类不同。
6、进一步地，所述胺活性荧光染料的荧光种类、抗人cd63的荧光种类和抗人cd193抗体的荧光种类均不同，且需要根据流式细胞仪的激光和滤光片的配置进行自由组合。
7、进一步地，所述fcr阻断剂的有效成分包括人免疫球蛋白或与使用的流式抗体同一种属且亚型相同的不相关的免疫球蛋白。
8、进一步地，所述的红细胞裂解液为渗透压低于血浆渗透压的溶液。
9、进一步地，所述的洗涤缓冲液为渗透压等于血浆渗透压的溶液。
10、本专利技术还提供了利用上述试剂盒检测人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的方法，包括以下步骤：
11、s1，取10～200μl静脉血液按照1～10×105个白细胞/100μl的体系与0.1～10μldmso溶解的死细胞染料和0.1～10μl fcr阻断剂混合后，4～40℃孵育5～30min，得第一孵育细胞；
12、1～10×105个白细胞/100μl的体系中的100μl指的是细胞体积，1～10×105个白细胞/100μl的体系细胞状态最好，更利于与荧光染料、fcr和抗体进行生物学结合；
13、s2，将s1得到的第一孵育细胞按照1～10×105个白细胞/100μl的体系加入0.5～20μl荧光标记的抗人cd193和cd63抗体，均匀混合后4～40℃避光孵育5～30min，得第二孵育细胞；
14、s3，将s2获得的第二孵育细胞按照1～10×105个白细胞/100μl的体系与0.5～5ml红细胞裂解液均匀混合后4～40℃避光孵育5～30min，90～600g离心4～30min，弃上清后向细胞沉淀中按照1～10×105个白细胞/100μl的体系加入0.1～5ml洗涤缓冲液重悬，90～600g离心4～30min；
15、s4，将s3得到的细胞沉淀用洗涤缓冲液调整细胞浓度为1～10×105个/ml，用流式细胞仪检测cd193和cd63的表达水平，并计算出嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的比例、数量和脱颗粒水平；
16、所述嗜本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：死细胞染料、FcR阻断剂、荧光标记的抗人CD63和CD193抗体、红细胞裂解液、洗涤缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述死细胞染料为胺活性荧光染料。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述胺活性荧光染料的荧光种类为Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC、APC/Cy7、APC/Cy7、APC/H7、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 510、Brilliant Blue 515、Brilliant Violet 570、Brilliant Violet 605、Brilliant Violet 650、BrilliantViolet 711、Brilliant Violet 785、FITC、LEAF、Pacific Blue、PE、PE/Cy5、PE/Cy7、PE/Dazzle、PerCP和Pe
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人CD63和CD193抗体的荧光种类为Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700、APC、APC/Cy7、APC/Cy7、APC/H7、Brilliant Violet 421、Brilliant Violet 510、Brilliant Blue515、Brilliant Violet 570、Brilliant Violet 605、Brilliant Violet 650、BrilliantViolet 711、Brilliant Violet 785、FITC、LEAF、Pacific Blue、PE、PE/Cy5、PE/Cy7、PE/Dazzle、PerCP和PerCP/Cy5.5中的任意两种组合，且与胺活性荧光染料的荧光种类不同。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述胺活性荧光染料的荧光种类、抗人CD63的荧光种类和抗人CD193抗体的荧光种类均不同，且需要根据流式细胞仪的激光和滤光片的配置进行自由组合。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述FcR阻断剂的有效成分包括人免疫球蛋白或与使用的流式抗体同一种属且亚型相同的不相关的免疫球蛋白。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的红细胞裂解液为渗透压低于血浆渗透压的溶液。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤缓冲液为渗透压等于血浆渗透压的溶液。
9.利用权利要求1-8任一项所述的试剂盒检测人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的方法，包括以下步骤：
10.一种权利要求1所述的试剂盒在人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测人血液嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：死细胞染料、fcr阻断剂、荧光标记的抗人cd63和cd193抗体、红细胞裂解液、洗涤缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述死细胞染料为胺活性荧光染料。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述胺活性荧光染料的荧光种类为alexa fluor 488、alexa fluor 594、alexa fluor 647、alexa fluor 700、apc、apc/cy7、apc/cy7、apc/h7、brilliant violet 421、brilliant violet 510、brilliant blue 515、brilliant violet 570、brilliant violet 605、brilliant violet 650、brilliantviolet 711、brilliant violet 785、fitc、leaf、pacific blue、pe、pe/cy5、pe/cy7、pe/dazzle、percp和percp/cy5.5中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人cd63和cd193抗体的荧光种类为alexa fluor 488、alexa fluor 594、alexa fluor 647、alexa fluor 700、apc、apc/cy7、apc/cy7、apc/h7、b...
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