【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物信息学，具体涉及一种基于低钾胁迫的红阳猕猴桃植株的差异表达shaker基因及其获取方法。
技术介绍
1、钾是植物生长所必须的大量元素，其内含量仅次于氮。钾离子对植物气孔开闭、细胞吸收水分以及植物光合作用有直接调节作用，也可以作为多种酶的活化剂参与植物蛋白质的合成、代谢作用。此外，钾离子在提高植物蛋白质稳定性方面也起着重要的作用。
2、植物体内钾离子通道蛋白可划分为shaker、tpk、kir-like三个基因家族。shaker通道被认为是维持植物体内k+最重要的蛋白，在植物体内参与k+的营养吸收、调节细胞内k+稳态与转运。1992年，anderson等人在拟南芥中克隆出首批k+通道基因kat1，并对其进行了鉴定。迄今为止，在拟南芥中共鉴定出9个shaker基因家族成员，根据与k+通道蛋白的作用关系被分为5个亚族。目前，随着基因组学和遗传学的发展，shaker k+通道蛋白基因家族的研究已经在白菜、谷子、蔷薇、甘薯等多种植物中完成了全基因组鉴定与分析，但目前为止，还没有关于猕猴桃shaker k通道家族的相关研究。
技术实现思路
1、针对现有技术缺乏猕猴桃shaker k通道家族的相关研究的问题，本专利技术提出一种基于低钾胁迫的红阳猕猴桃植株的差异表达shakerk基因及其获取方法。
2、本专利技术的基于低钾胁迫的红阳猕猴桃植株的差异表达shakerk基因，包括差异显著的acshaker15、acshaker17和acshaker22，其转录
3、acshaker15转录因子的的核苷酸序列sequence1；
4、acshaker17转录因子的的核苷酸序列sequence2；
5、acshaker22转录因子的的核苷酸序列sequence3。
6、所述低钾胁迫下红阳猕猴桃植株的差异表达shaker基因通过以下方式获得：
7、1)样本选取：选取红阳猕猴桃新鲜健康的叶片为外植体获得组培苗，再将生长大小、根系长度大致相等的组培苗接入低钾胁迫培养基和对照组培养基中。所述低钾胁迫培养基nh4no3为600mg/l、kno3为100mg/l，该培养基是在ms培养基的基础上，通过减少kno3的浓度来减少培养基中k+，并增加nh4no3浓度以弥补失去kno3中的no3，筛选出最佳的生根配方，为600mg/l nh4no3+100mg/l kno3+170mg/l kh2po4+370mg/l mgso4·7h2o+440mg/lcacl2·2h2o+0.83mg/l ki+6.2mg/l h3bo3+22.3mg/l mnso4·4h2o+8.6mg/l znso4·7h2o+0.25mg/l na2moo4·2h2o+0.25mg/l cuso4·5h2o+0.025mg/l cocl2·6h2o+37.25mg/lna2.edta+27.85mg/l feso4·7h2o+100mg/l肌醇+2mg/l甘氨酸+0.1mg/l vb1+0.5mg/l vb6+0.5mg/l烟酸+1.5mg/l 6-ba+0.1mg/l naa+4.5g/l agar+15g/l蔗糖；所述对照组培养基nh4no3为450mg/l、kno3为300mg/l，接种后将组培苗放于26±1℃的培养室中培养，培养10d后将组培苗取出，在液氮里取植株根作为转录组测序的样本。
8、2)测序及分析：对样本进行转录组测序及分析，转录组测序数据选用中华猕猴桃全基因组作为参考基因组，bowtie2软件进行序列比对，然后利用rsem软件调用bowtie2的比对结果进行统计，获得差异表达基因rna序列；将转录组测序所得rna序列逆转录至cdna，通过qrt-pcr分析得到转录组测序中3个差异表达基因。
9、qrt-pcr分析的步骤为：
10、1)以拟南芥shakerk+通道蛋白基因家族的蛋白质序列为对照，对猕猴桃基因组蛋白质数据进行blast和hmmsearch搜索；
11、2)通过cdd和pfam对猕猴桃shaker基因家族进行预测，去除缺失或不存在的结构域，最终共鉴定出28个shaker基因，并根据其在染色体上的位置将其命名为acshaker1-acshaker28；
12、3)将在常规培养基中培养的红阳猕猴桃植株的转录组数据作为对照组，结果显示，在低k胁迫下，共发现了28个acshaker表达基因，其中acshaker15、acshaker17、acshaker22差异表达显著，acshaker15和acshaker17基因表现为下调，acshaker22基因表现为上调。
13、shaker k+通道是高等植物中参与k+的吸收与抗胁迫的典型k+通道。研究表明植物中的shaker k+通道蛋白与果蝇中的shaker k+蛋白结构高度相似。近年来，人们根据电压依赖性和k+跨膜运输方向，shakerk+通道可分为内向整流、外向整流和每周整流k+通道三大类型。虽然shaker k+基因家族的成员已经在不同植物中被鉴定和分析，但是对中华‘红阳’猕猴桃的shaker k+通道家族知之甚少。相对于其他物种，红阳猕猴桃的shaker基因家族具备特异性：本专利技术在红阳猕猴桃中鉴定出了28个shaker k+通道基因，而在拟南芥中鉴定出9个，大豆中鉴定出14个，甘薯中鉴定出32，说明不同物种改的shaker k+通道蛋白基因数量差异较大。
14、本专利技术的有益效果在于：
15、通过减少ms培养基中的k含量，对‘红阳’猕猴桃组培苗进行缺素处理。实验时红阳猕猴桃在450mg/l nh4no3，300mg/l kno3中仍未达到缺k水平，将该浓度下的ms培养基作为对照组培养基；在nh4no3为600mg/l，kno3为100mg/l时，组培苗缺素最严重，虽然能看到苗在生长，但在生长质量上几乎为负增长，且该组合的组培苗在后期，叶片边缘均为红色或褐色，将该浓度下的ms培养基作为低钾胁迫培养基，用该组合进行后续转录组分析，进而分析shaker基因家族成员的表达谱。作为验证，对缺钾30天后植株叶及根表型观测，结果显示，缺钾后的植株普遍出现叶边缘变红的现象，根及根毛数量相较于对照组有明显增加，且根长较对照组更长，有明显的缺钾症状，因此选取的缺钾培养基和对照组培养基科学性较好。
16、结合低k胁迫下红阳猕猴桃的转录组对shaker基因家族的表达模式进行了分析，28个shaker基因在低k胁迫下均可以检测到表达，转录水平较高，其中有3个基因的差异表达水平达到了显著差异水平。取差异显著的acshake差异基因做qrt-pcr验证，qrt-pcr的结果与转录组测序结果相关性较高，证明了转录组据的准确性，验证了转录组数据与差异基因的可靠性。acshaker22基因属于ⅳ(kc1)亚族，属于k通道蛋白家族shaker的一个亚基，主要在根上表达；acshaker15和acshaker17基因属于ⅲ本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.低钾胁迫下红阳猕猴桃植株的差异表达Shaker基因，其特征在于包括差异显著的AcShaker15、AcShaker17和AcShaker22：
2.低钾胁迫下红阳猕猴桃植株的差异表达Shaker基因的获取方法，其特征在于通过以下方式获得：：
【技术特征摘要】
1.低钾胁迫下红阳猕猴桃植株的差异表达shaker基因，其特征在于包括差异显著的acshaker15、acshaker17和ac...
【专利技术属性】
技术研发人员：张汉尧，张智铭，字银强，刘小珍，尹拓，
申请(专利权)人：西南林业大学，
类型：发明
国别省市：
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