【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物病毒，具体为一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺。
技术介绍
1、痘苗病毒是有包膜的双链dna病毒，已经被广泛地运用到疾病或生物学研究中，目前痘苗病毒下游纯化工艺主要面临的难题是缺乏有效的纯化手段去除样品中的宿主细胞dna残留（hcd），各国法规均要求对hcd残留量和片段大小进行控制，建议尽量将残留hcd控制在10ng/剂以内，将hcd残留片段大小控制在200bp以下。
2、目前常见的痘苗病毒纯化工艺一般使用离子交换层析结合酶切来去除hcd，但由于痘苗病毒较大的分子量以及复杂的结构，导致离子交换层析回收率通常只有不到30%，并且离子交换层析需要使用大量的层析缓冲液，给无菌保证也提出了更高的要求，所以离子交换层析并不适用于痘苗病毒规模化生产，此外痘苗病毒具有包膜结构，相对于其它病毒更容易形成高度聚集的复合体，而被包裹的hcd无法通过普通的酶切条件来去除。
3、为此，需要设计相应的技术方案给予解决。
技术实现思路
1、（一）解决的技术问题
2、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺，解决了痘苗病毒较大的分子量以及复杂的结构，导致离子交换层析回收率通常只有不到30%，并且离子交换层析需要使用大量的层析缓冲液，给无菌保证液提出了更高的要求，离子交换层析不适用于痘苗病毒规模化生产，相对于其它病毒更容易形成高度聚集的复合体，而被包裹的hcd无法通过普通酶切条件来去除的技术问题。
3、（二
4、为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺，方法步骤包括如下：
5、s1、首先对病毒收获液进行澄清处理；
6、病毒收获液用孔径0.45μm~5μm的过滤器或孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理；
7、s2、然后用中空纤维柱对澄清液进行浓缩和洗滤；
8、用100kd~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度，然后用洗滤液将浓缩液洗滤3~8次，排空中空纤维柱管路，收集浓缩液；
9、s3、接着对浓缩液进行酶切处理；
10、向浓缩液中加入终浓度为10~1000mm的nacl、0.1%~3%的聚山梨酯80或聚山梨酯20和5~250u/ml的核酸酶，酶切反应20min以上；
11、s4、最后使用复合层析对酶切样品进行精纯，最终样品hcd残留量可降至10ng/剂量以下；
12、将复合层析填料用naoh溶液消毒以及缓冲液平衡后将酶切收样品上样和洗脱收集病毒峰。
13、优选的，步骤s1中，使用孔径0.45μm~5μm的过滤器进行澄清处理的方法步骤包括如下：
14、s101，准备过滤器：选择孔径在0.45μm至5μm范围内的过滤器；
15、s102，预处理过滤器：根据过滤器的使用说明，对过滤器进行必要的预处理，包括有湿润和冲洗，用于确保过滤效果；
16、s103，过滤病毒收获液：将病毒收获液通过准备好的过滤器进行过滤，大颗粒的杂质将被过滤器截留，而病毒则能够顺利通过，用于实现边过滤边收集；
17、使用孔径0.45μm~0.65μm的中空纤维柱进行澄清处理的方法步骤包括如下：
18、s201，准备中空纤维柱：选择孔径在0.45μm至0.65μm范围内的中空纤维柱；
19、s202，组装中空纤维柱：将纤维柱与设备连接，并确保其密封性良好；
20、s203，预处理纤维柱：在正式使用前，对纤维柱进行必要的预处理，包括消毒、平衡和冲洗，用于确保其过滤效果；
21、s204，过滤病毒收获液：将病毒收获液泵入中空纤维柱中，大颗粒的杂质将被纤维柱截留，而病毒则能够顺利通过，通过管路进入收集瓶中。
22、优选的，步骤s2中，使用100kd~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度的过程，包括以下步骤：
23、s301，准备设备：首先，需要确保100kd~0.1μm中空纤维柱或膜包已正确安装并与系统连接，中空纤维柱具有特定的孔径，能够允许小分子和溶剂通过，而病毒被截留，从而实现浓缩效果；
24、s302，浓缩操作：将澄清液泵入中空纤维柱或膜包中，随着液体的流动，大分子物质将被截留在柱内或膜包中，而小分子和溶剂则通过膜孔流出，此过程会导致目标物质在柱内或膜包内逐渐被浓缩至目标浓度。
25、优选的，步骤s2中，使用病毒保存液将浓缩液洗滤3~8次的具体方法步骤包括如下：
26、s401，准备病毒保存液：首先，确保病毒保存液已经准备好，并且其质量和浓度符合实验要求；
27、s402，进行洗滤：将病毒保存液缓慢地泵入浓缩液中，通过控制流速和和跨膜压力将浓缩液洗滤3~8次，确保浓缩液中的杂质被有效去除；
28、s403，收集洗滤液：当达到预定的洗滤次数或洗滤液的质量达到预期要求时，停止洗滤，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液；
29、s404，清洗与维护：对中空纤维柱或膜包进行清洗，用于去除残留的物质，并保持其性能。
30、优选的，步骤s2中，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液的具体方法步骤包括如下：
31、s501，停止洗滤：首先，使用病毒保存液进行洗滤的次数达到预定的3~8次后，停止洗滤过程；
32、s502，收集样品：打开相应的阀门，将中空纤维柱或膜包中以及管路中的样品排空到收集瓶中；
33、s503，冲洗管路：用适量洗滤液将管路中残留的样品冲洗到收集瓶中，注意观察收集口样品的颜色和澄清度，用于确认是否已经完全冲洗干净，以保证回收率；
34、s504，记录与检测：在收集浓缩液的过程中，应记录收集的体积和时间，并对收集的浓缩液进行初步的质量检测，包括测定其浓度、纯度或hcd残留量；
35、s505，关闭系统与清理：对使用过的中空纤维柱、膜包和管路进行适当的清洗和消毒，关闭整个系统。
36、优选的，步骤s3中，酶切处理的具体步骤包括如下：
37、s601，准备酶切反应体系：首先，需要准备酶切反应所需的试剂和溶液，包括nacl母液、聚山梨酯80或聚山梨酯20溶液，以及核酸酶；
38、s602，向浓缩液中添加物料：根据样品中hcd的含量，向样品中加入终浓度为10~1000mm的nacl母液、0.1%~3%的聚山梨酯,5~250u/ml的核酸酶，并混合均匀；
39、s603，控制酶切反应条件：酶切反应在恒定的温度下进行，用于确保酶切效率和病毒样品的稳定性，控制反应的ph值和离子强度，以维持酶的最佳活性；
40、s604，进行酶切反应：在添加了物料并设置适当的反应条件后，开始进行酶切反应；
41、s605，终止酶切反应：当酶切反应达到预定时间或达到预期效果时，终止本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于，方法步骤包括如下：
2.根据权利要求1所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S1中，使用孔径0.45μm~5μm的过滤器进行澄清处理的方法步骤包括如下：
3.根据权利要求1所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S2中，使用100KD~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度的过程，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S2中，使用病毒保存液将浓缩液洗滤3~8次的具体方法步骤包括如下：
5.根据权利要求4所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S2中，排空中空纤维柱管路并收集浓缩液的具体方法步骤包括如下：
6.根据权利要求1所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S3中，酶切处理的具体步骤包括如下：
7.根据权利要求1所述的一种高效去除HCD残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤S4中，
...【技术特征摘要】
1.一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于，方法步骤包括如下：
2.根据权利要求1所述的一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤s1中，使用孔径0.45μm~5μm的过滤器进行澄清处理的方法步骤包括如下：
3.根据权利要求1所述的一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺，其特征在于：步骤s2中，使用100kd~0.1μm中空纤维柱或膜包将澄清液浓缩至目标浓度的过程，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的一种高效去除hcd残留的痘苗病毒纯化工艺，...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘辉，陈彦平，黄伟东，
申请(专利权)人：深圳源兴基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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