一类用于端粒酶活性检测的引物制造技术

一类新型的用于端粒酶活性检测的引物。该引物的序列特征为：５′－环序列１－Ｇｊ－环序列２－Ｇｎ－环序列３－Ｇｍ－环序列４－３′；其中：ｊ、ｎ、ｍ＝２－６，环序列４与人端粒序列相同，即该序列为Ｔ、ＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＡＧ或ＴＴＡＧＧ。该引物中包含有３组连续的鸟嘌呤（Ｇ）序列。当以此引物作为端粒酶引物时，在端粒酶的作用下，该引物的３′－端可再延伸出一组连续Ｇ序列，从而使设计的引物满足Ｇ－四联体的形成条件，并可在特定条件下形成Ｇ－四联体结构，形成的Ｇ－四联体结构与氯化血红素结合后可以显示过氧化物酶活性，催化过氧化氢氧化２，２′－氨基－二（３－乙基－苯并噻唑啉－６－磺酸）的反应，根据反应体系在λ＝４２２ｎｍ的吸光度变化可进行端粒酶活性的检测。检测操作简便，试剂价廉，检测灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一类用于端粒酶活性检测的引物
本专利技术涉及一类新型的用于端粒酶活性检测的引物设计方案，属于生物

技术介绍
目前，癌症已经成为了人类健康的第一杀手。研究发现细胞永生化是肿瘤细胞区 别于正常细胞的重要特征之一，也是肿瘤生长和转移的关键。研究发现细胞的寿命是由端 粒的长度决定的。端粒是位于真核细胞线性染色体末端的一种特殊结构。在正常细胞中， 随着细胞分裂的进行，端粒DNA不断縮短，当其縮短到一个临界值后，细胞停止分化，并出 现程序性死亡。而在大多数肿瘤细胞中，由于存在着一种特殊的活性酶类，可以使端粒的长 度不随细胞分裂次数的增加而縮短，而且可以延长端粒，帮助细胞跨越衰老、危象而达到永 生。这种酶被称之为端粒酶(telomerase)。专家预测，端粒酶的活性分析可用于癌症的早 期诊断及恶性程度判断。 目前，端粒酶活性的检测研究已成为国际上的研究热点，并已有多种方法见诸 报道。在这些方法中，以Kim等人于1994年建立的端粒重复扩增法(Telomeric r印eat amplification protocol, TRAP)最为引人注目。在此基础上，人们不断进行改良，提出了一 系列端粒酶活性检测的新方法。这些检测方法包括TRAP引物改良法、亲合闪烁分析-TRAP 法、TRAP-酶联免疫吸附分析法、杂交保护分析-TRAP法、比色杂交分析-TRAP法等。但就 这些方法而言，都存在着一定的缺陷与不足，PCR扩增技术的使用增加了样品间交叉污染的 危险性，这就为它们在临床上的应用推广设置了一定的障碍。 开发一种简便、价廉的端粒酶活性检测技术，省去对PCR扩增的需求无疑具有极 大的吸引力。为此，Willner等人开发了一种用于端粒酶活性检测的催化分子信标方法。 通过将一段可形成G-四联体结构的DNA序列巧妙地包埋在分子信标的发夹结构当中，使其 不能形成G-四联体结构，而当该分子信标的3'-端在端粒酶的作用下延伸出端粒重复序 列以后，分子信标的环部序列与延伸出的端粒重复序列结合而导致分子信标的发夹结构打 开，G-四联体结构重新形成。该G-四联体与氯化血红素结合后可催化过氧化氢氧化多种 底物的反应，产生可测的吸收信号或化学发光信号，从而实现端粒酶活性的检测。这种方法 的开发为端粒酶活性的检测开辟了一个全新的方向，在此基础上，可望开发出简便、价廉的 端粒酶活性检测方法，克服传统端粒酶活性检测方法的一些缺陷，进而实现在临床上的推 广及应用。但就该方法而言，同样存在一定的缺陷与不足，如(l)该方法所用的端粒酶引 物上包含有四组连续的G序列，即自身满足了 G-四联体形成的条件。虽然通过将这部分序 列包埋于发夹结构中的方法阻止了部分G-四联体的形成，但这种阻止作用并不完全。即这 种方法存在较强的背景信号，从而在一定程度上影响了检测的灵敏度。(2)该方法中，引物 在端粒酶的作用下延伸出较长的端粒重复序列(至少2个以上的端粒重复序列)后才能导 致G-四联体结构的形成，从而产生可测的信号。也就是说，该方法要求检测的端粒酶具有 较高的活性，这也在一定程度上影响了检测的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术目的是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一类全新的用于端粒酶活性检 测的引物，使用该类引物，可建立一种简便、价廉的端粒酶检测方法，省去了对传统的PCR 扩增的需求，可实现端粒酶活性的快速检测。 本专利技术提供的一类用于端粒酶活性检测的引物中包含有三组连续的鸟嘌呤G序 列，引物的序列特征如下 5'-环序列l-Gj-环序列2-Gn-环序列3-Gm-环序列4-3' 其中j = 2-6 ;n = 2-6 ;m = 2-6， 环序列4与人端粒序列相同，即该序列为T、 TT、 TTA、 TTAG或TTAGG。 环序列1、2、3可以是任意序列。 所设计的引物可以是但不限於 序列1 5, _tgggtagggcgggtt￡i_3, 序列2 5, _tgggtagggcgggtt_3, 序列3 5, _tgggtgggtgggtta_3, 序列4 5, _tgggtgggtgggtt_3, 序列5 5, _tgggtgggcgggtta_3, 序列6 5, _tgggtgggcgggtt_3, 序列7 5, _tgggtegggtgggtte_3, 序列8 5, _tgggtagggtgggtt_3, 序列9 5, _tgggtgggagggtte_3, 序列10 5, _tgggtgggagggtt_3, 序列11 5, tgggagggcgggtte_3, 序列12 5, _tgggagggcgggtt_3,(其中斜体加黑的ggg为3组连续的鸟嘌呤G序列，其余的为环序列) 本专利技术设计的引物包含有3组连续的G序列，引物自身不能满足G-四联体的形成条件。而在端粒酶的作用下，该引物的3'-端可再延伸出一组连续G序列，从而满足G-四联体的形成条件，并在特定条件下可以形成G-四联体，该四联体与氯化血红素结合后可以显示过氧化物酶活性，催化过氧化氢氧化2，2'-氨基-二 (3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)的反应产生绿色产物，同时体系在A 二 422nm处的吸光度增强。根据测试样品体系与阴性对照(将测试样品加热使端粒酶失活)之间产生的吸光度差别的大小可对端粒酶的活性进行大致的判断。 利用该引物进行端粒酶活性检测的大致机理如图1所示 端粒酶引物的合理设计是这一方法的关键因素，设计的引物应满足下面四个条件(1)引物自身不能形成G-四联体结构；(2)引物在活性端粒酶的作用下3'-端可以进行延伸；(3)延伸产物可以形成G-四联体结构；(4)形成的G-四联体结构在与氯化血红素结合后具有过氧化物酶活性。为满足这些条件，我们设计的引物中包含有3组连续的G序列，连续G序列中核苷酸G的个数在2-6之间。该端粒酶引物的3'-端的序列与人端粒序列相同。 利用本专利技术的端粒酶引物进行端粒酶活性测定的优点和积极效果如下 (1)操作简便，省去了常用的PCR扩增步骤，不仅消除了因PCR产物交叉污染造成假阳性检测结果的危险性，而且使其更加适用于大批量样品的快速测定；(2)试剂价廉，端粒酶引物上不需要进行任何标记，同时不需要任何特殊、昂贵的仪器，只需普通的紫外_可见分光光度计即可；(3)与Willner等人开发的方法相比，该方法所具有的优点如下(a)端粒酶引物上只含有三组连续的G-序列，自身不存在形成分子内G-四联体的可能性，因此极大地减弱了背景信号对检测灵敏度所带来的不利影响；(b)在端粒酶的作用下，端粒酶引物只需要延伸出一组连续G序列，延伸出的片段明显要短得多，从而有利于增加端粒酶的周转率(turnover)，使更多的端粒酶引物得以延伸，从而生成更多的具有催化能力的G-四联体，进而可极大地提高检测的灵敏度。附图说明 图1是利用设计的引物进行端粒酶活性检测的机理图示。 图2是利用模拟端粒酶产物验证设计的引物用于端粒酶活性检测的可行性。(1)氯化血红素单独存在下的催化反应；(2)端粒酶引物存在下的氯化血红素的催化反应；(3)端粒酶引物模拟延伸产物存在下的氯化血红素的催化反应。 图3是用设计的引物进行白血病HL-60细胞中端粒酶活性检测的结果。(1)被测样品的检测结果；(2)阴性对照的检测结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类用于端粒酶活性检测的引物，其特征在于该引物中包含有三组连续的鸟嘌呤Ｇ序列，引物的序列特征如下：　　５′－环序列１－Ｇｊ－环序列２－Ｇｎ－环序列３－Ｇｍ－环序列４－３′　　其中：ｊ＝２－６；ｎ＝２－６；ｍ＝２－６，　　环序列４与人端粒序列相同，即该序列为Ｔ、ＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＡＧ或ＴＴＡＧＧ。

【技术特征摘要】
一类用于端粒酶活性检测的引物，其特征在于该引物中包含有三组连续的鸟嘌呤G序列，引物的序列特征如下5′-环序列1-Gj-环序列2-Gn-环序列3-Gm-环序列4-3′其中j＝2-6；n＝2-6；m＝2-6，环序列4与人端粒序列相同，即该序列为T、TT、TTA、TTAG或TTAGG。2. 根据权利要求l所述的引物，其特征在于该引物的序列可以是但不限于下列序列序列1`5, -tgggtegggcgggtte-3,序列2`5, _tgggtegggcgggtt_3,序列3`5, _tgggtgggt...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔德明，蔡莉莉，沈含熙，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]