【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种突变型pfu dna聚合酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、聚合酶链式反应(pcr)能方便、快捷、准确地大规模复制目的基因片段，已成为现代分子生物学中不可或缺的实验技术，在医学检测、病原微生物检测、法医学鉴定以及食品安全检测等诸多领域应用广泛。
2、pcr技术在应用于血源基因扩增时，由于血液样品中含有血红蛋白、免疫球蛋白g、乳铁蛋白以及抗凝剂等对pcr反应具有抑制作用的物质，pcr反应前需要纯化样品中的基因组dna。然而，这种纯化往往不能完全去除抑制物对pcr扩增的不良影响，而且，纯化还容易造成样品的交叉污染，影响pcr结果的准确性和可靠性。
3、耐热型dna聚合酶作为pcr反应的核心工具，其性能好坏决定了pcr产物的特异性、产量及保真性，高性能的dna聚合酶的获得对于pcr反应至关重要。pfu dna聚合酶来源于嗜热火球菌属，是迄今为止最常见的高保真dna聚合酶，其不仅具有5’-3’聚合酶活性，还具有3’-5’外切核酸酶活性，其中3’-5’外切核酸酶活性在聚合反应中可以纠正错误掺入的碱基，应用于pcr时可以特异性、高保真地扩增dna片段。但是，野生型pfu dna聚合酶在进行pcr反应时也存在不少缺陷，如延伸速率慢、延伸能力不够，无法对长片段的dna进行扩增，且耐抑制剂的能力较差，在血液样品的pcr反应中扩增效率低。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种突变型pfu dna聚合酶及其制备方法和应用，可以有效解决上述问题。
3、本专利技术提供一种突变型pfu dna聚合酶，其氨基酸序列如seq id no:1或seq idno:2所示。
4、本专利技术提供一种编码上述的突变型pfu dna聚合酶的dna分子，其碱基序列为seqid no:3或seq id no:4所示。
5、本专利技术进一步提供一种重组表达载体，将上述的突变型pfu dna聚合酶的dna分子克隆入表达载体得到。
6、本专利技术还进一步提供一种能高效可溶表达上述的突变型pfu dna聚合酶的重组工程细胞株，为将上述的重组表达载体转化入工程细胞得到。
7、本专利技术进一步提供一种突变型pfu dna聚合酶的制备方法，包括如下步骤：
8、将上述的突变型pfu dna聚合酶的重组工程细胞株活化，得到重组工程细胞种子液；将所述重组工程细胞种子液接种于含抗生素的培养液中培养、诱导后，离心收集菌体沉淀；
9、然后将菌体沉淀重悬、超声破碎菌体，离心，收集上清液；再将所述上清液离心，去除沉淀，过滤，得到滤液；
10、最后将所述滤液依次经过镍离子亲和层析、阳离子交换层析，得到突变型pfu dna聚合酶。
11、具体的，作为进一步改进的，所述突变型pfu dna聚合酶的制备方法，包括如下步骤：
12、(1)将能高效可溶表达上述突变型pfu dna聚合酶的重组工程细胞株活化，得到重组工程细胞种子液；
13、(2)将重组工程细胞种子液按一定比例接种于含抗生素的tb培养液中，于35～38℃、150～200rpm条件下培养至菌液od600达到0 .6～0 .8；
14、(3)向菌液中加入iptg至终浓度为0 .1～0 .3mmol/l，于16～20℃诱导16～20h后，离心收集菌体沉淀；
15、(4)用预冷的裂解液将步骤(3)得到的菌体沉淀重悬，使菌体分散均匀；
16、(5)冰浴中超声破碎菌体，离心，收集上清；
17、(6)将上清液于70～80℃水浴保温20～40min ，离心，去除沉淀；将得到的上清过滤，得到滤液；
18、(7)将滤液进行镍离子亲和层析，收集含有目的蛋白的样品；
19、(8)把经镍离子亲和层析收集的样品再经阳离子交换层析，得到突变型pfu dna聚合酶。
20、本专利技术进一步提供一种pcr反应试剂盒，包括上述的突变型pfu dna聚合酶。
21、本专利技术进一步提供一中上述的pcr反应试剂盒，还包括：pcr用水、pcr反应缓冲液和dntps以及上下游引物。
22、作为进一步改进的，上述的pcr反应试剂盒中：所述的pcr反应缓冲液包括：80～200 mmol/l tris-hcl、2～15 mmol/l mgcl2、5～30 mmol/l(nh4)2so4、200～500 mmol/lkcl、0.1～1 g/l bsa、0.05％～0.1 ％ tritonx-100，ph值为8～10。
23、作为进一步改进的，优选的，更优选如下：90～200 mmol/l tris-hcl、5～15mmol/l mgcl2、10～30 mmol/l(nh4)2so4、250～500 mmol/l kcl、0.2～1 g/l bsa、0.05％～0.1％ triton x-100，ph值为8～10。
24、作为进一步改进的，所述的dntps在pcr反应体系中的浓度优选为0.01～50μmol/l；更优选为0.1～50 μmol/l。
25、作为进一步改进的，所述的pcr反应缓冲液中含有1，2-丙二醇、蔗糖、二甲基砜、peg8000、亚精胺、海藻糖和甜菜碱中的至少一种。
26、作为进一步改进的，所述的突变型pfu dna聚合酶在pcr反应体系中的浓度优选为1～50 u/l。
27、作为进一步改进的，所述上下游引物的浓度为0.1~1μmol/l。
28、本专利技术进一步提供一种上述的pcr反应试剂盒在血液dna样本、小鼠肝脏样本、小鼠肌肉样本、拟南芥叶片组织或水稻叶片组织中扩增中的应用，包括如下步骤：以从血液样本中纯化得到的基因组为模板或以从小鼠肝脏、肌肉样本中纯化得到的基因组为模板，或以从拟南芥叶片样本中纯化得到的基因组为模板，或以从水稻叶片组织中纯化得到的基因组为模板；添加引物和所述的pcr反应试剂盒，进行pcr反应。
29、作为进一步改进的，所述的模板优选的，以含基因组dna 0.2～20 mg/l计算。
30、本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的突变型pfu dna聚合酶及其制备方法和应用，其表达方案得出的pfu突变体样品表达量更高，可达15mg/l以上；样品纯度更高，可达95%以上；样品酶活性更高，可达156 u/μl；且样品热稳定性更好，95 ℃条件下，半衰期大于18 h，98 ℃下半衰期大于3 h。进一步的，本案中的氨基酸序列seq id no:1的突变型pfu dna聚合酶具有更好的稳定性，而seq id no:2突变型pfu dna聚合酶具有更好的底物亲和力和反应时的延伸速度。
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1.一种突变型Pfu DNA聚合酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。
2.编码权利要求1所述的突变型Pfu DNA聚合酶的DNA分子，其特征在于：其碱基序列为如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:4所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于：将权利要求2所述的突变型Pfu DNA聚合酶的DNA分子克隆入表达载体得到。
4.一种能高效可溶表达权利要求1所述的突变型Pfu DNA聚合酶的重组工程细胞株，其特征在于：为将权利要求3所述的重组表达载体转化入工程细胞得到。
5.一种突变型Pfu DNA聚合酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
6.一种PCR反应试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的突变型Pfu DNA聚合酶。
7.如权利要求6所述的PCR反应试剂盒，其特征在于：还包括：PCR用水、PCR反应缓冲液和dNTPs以及上下游引物。
8.如权利要求7所述的PCR反应试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应缓冲液包括：80～200 mmol/L
9.权利要求6或7或8所述的PCR反应试剂盒在血液DNA样本、小鼠肝脏样本、小鼠肌肉样本、拟南芥叶片组织或水稻叶片组织中扩增中的应用，其特征在于，包括如下步骤：以从血液样本中纯化得到的基因组为模板或以从小鼠肝脏、肌肉样本中纯化得到的基因组为模板，或以从拟南芥叶片样本中纯化得到的基因组为模板，或以从水稻叶片组织中纯化得到的基因组为模板；添加引物和所述的PCR反应试剂盒，进行PCR反应。
...【技术特征摘要】
1.一种突变型pfu dna聚合酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:1或seq idno:2所示。
2.编码权利要求1所述的突变型pfu dna聚合酶的dna分子，其特征在于：其碱基序列为如seq id no:23或seq id no:4所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于：将权利要求2所述的突变型pfu dna聚合酶的dna分子克隆入表达载体得到。
4.一种能高效可溶表达权利要求1所述的突变型pfu dna聚合酶的重组工程细胞株，其特征在于：为将权利要求3所述的重组表达载体转化入工程细胞得到。
5.一种突变型pfu dna聚合酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
6.一种pcr反应试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的突变型pfu dna聚合酶。
7.如权利要求6所述的pcr反应试剂盒，其特征在于：还包括：pcr用水、pcr反应缓冲液和dntps以及上下游引物。
8.如权利要求7所述的pcr反应试剂盒，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：林黄昱，崔伟斌，
申请(专利权)人：厦门康基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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