【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光电化学免疫传感，具体涉及一种用于检测非小细胞肺癌生物标志物egfr的pec免疫传感器的开发与应用。
技术介绍
1、癌症一般由细胞的恶性增殖引起，在所有类型的癌症中，肺癌的5年生存率为7%-25%，是因癌症死亡的最常见原因。非小细胞肺癌（nsclc）是一种异质性肿瘤，约占所有新发肺癌的85%，由于筛查实践不足和临床症状迟发，大多数患者在疾病的晚期才被诊断，导致不良的预后和临床结果。egfr异常表达是nsclc的重要驱动基因之一，正常人血清中egfr水平为1032±485pg/ml，当超出这一范围时，提示存在异常表达的可能，因此测定egfr水平在nsclc的早期筛查、疗效评估和临床治疗中具有重要的意义。
2、目前已有多种方法应用于egfr的分析，如荧光、聚合酶链反应、电化学（ec）和光电化学（pec）。这些方法在egfr检测中均取得了一定的成果，其中，pec免疫传感器由于高特异性、高灵敏度、低干扰、低成本等优势，在细菌、细胞、蛋白质、核酸、有机分子等各种靶标分析中表现出巨大的潜力。pec传感器的分析性能主要由光活性材料本身的性质和光电响应决定。氢键有机骨架（hofs）材料是一类由分子间氢键组装形成的有序多孔材料，半导体性质和有序的孔道结构有效的提高了光生电子的转移效率。量子点（qds）是一种纳米尺度上的半导体材料，具有强光吸收能力、高荧光量子效率和可调节的带隙能量等性质，在pec
已得到了广泛的应用。本研究合成了hofs材料fju-200和cdse qd作为光敏材料，目前，尚未见到fju-200@c
3、本研究中以fju-200和cdse qds作为光活性材料构建了一种用于egfr检测的pec免疫传感器。向fju-200施加0.3v的偏置电压，表现出令人满意的pec信号，fju-200与cdseqds之间由于能带交错结构和内部电场而形成s型电子传递通路，加速了电荷转移，大大提高了电极的光电响应和稳定性。用含有-cooh的tga对电极进行修饰，抗体（ab）通过edc/nhs介导的酰胺化反应被捕获到电极表面，牛血清白蛋白（bsa）用于阻断非特异性结合位点，孵育egfr后通过与ab的特异性免疫识别形成复合物，增大空间位阻，阻碍界面的电子转移，光电流被猝灭。所构建的免疫传感器在医学领域有助于临床进行nsclc的早期筛查，制定诊疗方案，改善患者预后，为临床提供了一种新的分析方法。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于合成一种新型的fju-200@cdse异质结构，为pec技术光敏材料的合成提供更多选择的可能；本专利技术所构建的pec免疫传感器结合了pec技术操作简单、成本低、快速响应和抗原-抗体（ag-ab）免疫识别的高特异性的优势，通过构建响应信号与待测物浓度的标准曲线，可实现对肿瘤标志物egfr的灵敏检测。
2、本专利技术的目的在于构建一种更灵敏快速的pec免疫传感器用于egfr的检测，有利于临床对nsclc的筛查与诊断；本专利技术所构建的pec免疫传感器结合了pec技术操作简单、成本低、快速响应和抗原-抗体（ag-ab）免疫识别的高特异性的优势，通过构建响应信号与待测物浓度的标准曲线，可实现对肿瘤标志物egfr的灵敏检测。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案。
4、本专利技术一方面提供了一种pec免疫传感器，其特征在于，所述pec免疫传感器以fju-200和cdse作为光活性材料制备f&c/fto导电玻璃电极。
5、本专利技术第二方面提供了一种上述所述的pec免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
6、（1）fju-200 hof的合成：在圆底烧瓶中加入乙酸，将1,4,5,8-四羧基二酐悬浮在乙酸中，搅拌后向溶液中加入5-氨基间苯二甲酸，回流12~14h，反应冷却至室温后加入水以收集沉淀产物并用乙醇洗涤，在60℃下干燥，得到hl4前体粉末；将hl4粉末溶于n,n-二甲基甲酰胺（dmf），随后逐滴加入无水乙醇，超声溶解，溶液在100℃下干燥得到浅黄色粉末，即为fju-200粉末，备用；
7、（2）cdse的合成：在50ml水中加入硒粉和na2so3加热搅拌，过滤未反应完的硒粉，得到na2seso3溶液，另取100ml水，加入巯基乙酸（tga）和cdcl2·2.5h2o，利用naoh调节ph至10~11，磁力搅拌下加入na2seso3溶液，回流后得到cdse量子点溶液；
8、（3）f&c/fto导电玻璃电极的制备：将fju-200粉末溶于dmf，将等体积的fju-200溶液和cdse溶液混合并涡旋，将复合材料滴在fto电极表面，放入120℃烘箱中干燥，冷却后使用电化学工作站对f&c/fto光电流进行检测；
9、（4）pec免疫传感器的构建：在f&c/fto表面滴加tga引入羧基并用edc/nhs激活，随后孵育ab，ab中的氨基通过与羧基的反应被固定在电极表面，孵育bsa阻断非特异性结合位点，得到f&c/tga/edc/nhs/ab/bsa/fto的pec免疫传感器；
10、（5）构建标准曲线及样品检测：用pbs缓冲液溶解egfr冻干蛋白，将得到的标准溶液逐级稀释至不同的浓度，将各个浓度的egfr标准溶液分别孵育在f&c/tga/edc/nhs/ab/bsa/fto电极表面，放入电化学工作站中进行光电流检测，利用f&c/tga/edc/nhs/ab/bsa/fto和f&c/tga/edc/nhs/ab/bsa/egfr/fto光电流的变化和egfr标准溶液浓度的对数值构建线性关系，得到标准曲线，根据标准曲线获得待测样品中egfr的浓度。
11、进一步地，制备方法中步骤（1）中所述的乙酸体积为20~25ml，1,4,5,8-四羧基二酐质量为1.3~1.4g，搅拌时间为10~20min，5-氨基间苯二甲酸质量为1.75~1.85g，回流温度为105℃，用乙醇洗涤ph至7~7.5；所述的hl4粉末质量为22~26mg，dmf体积为4~6ml，无水乙醇体积为0.5~1ml，干燥时间为10~12h。
12、进一步地，制备方法中步骤（2）中所述的硒粉质量为0.78~0.82g，na2so3质量为1.45~1.55g，加热搅拌温度为90℃，搅拌时间为5~6h，tga体积为0.8~0.9ml，cdcl2·2.5h2o质量为1.1~1.2g，naoh浓度为1mol/l，na2seso3的添加体积为10~15ml，回流条件为105℃下回流4h。
13、进一步地，制备方法中步骤（3）中所述的dmf体积为5~6ml，涡旋时间为1~3min，f&c复合材料在电极表面的滴加体积为40~50µl，干燥时间为10~12h。
14、进一步地，制备方法中步骤（4）中所述的tga体积为2~3µl，反应时间为10~12h，edc/nhs体积为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PEC免疫传感器，其特征在于，所述PEC免疫传感器以FJU-200和CdSe作为光活性材料制备F&C/FTO导电玻璃电极。
2.一种权利要求1所述的PEC免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，（1）中所述的乙酸体积为20~25mL，1,4,5,8-四羧基二酐质量为1.3~1.4g，搅拌时间为10~20min，5-氨基间苯二甲酸质量为1.75~1.85g，回流温度为105℃，用乙醇洗涤pH至7~7.5；所述的HL4粉末质量为22~26mg，DMF体积为4~6mL，无水乙醇体积为0.5~1mL，干燥时间为10~12h；
4.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于，（3）中所述的DMF体积为5-6mL，涡旋时间为1-3min，F&C复合材料在电极表面的滴加体积为40-50µL，干燥时间为10~12h；
5.根据权利要求2所述的用于EGFR检测的PEC免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的标准溶液稀释后的浓度范围为10fg/mL~100 ng/mL，滴加
6.一种权利要求1所述的PEC免疫传感器在人血清样本中肺癌生物标志物EGFR的检测中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫传感器以FJU-200和CdSe作为光活性材料制备F&C/FTO导电玻璃电极，在电化学工作站中进行检测获得初始光电流，将不同浓度的抗原孵育在电极表面再次进行光电检测，利用抗原孵育前后光电流的变化拟合标准曲线，根据标准曲线对实际样品中的EGFR进行定量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，FTO为氟化锡掺杂氧化锡导电玻璃电极，测量光电流时的电极体系为CHI-660E电化学工作站标准的三电极体系，工作电极为F&C/FTO导电玻璃电极，辅助电极为铂丝，参比电极为Ag/AgCl，检测光源为420nm滤光片的氙灯，检测的溶液体系为浓度0.1M、pH为7.2~7.4的PBS缓冲液。
9.一种导电玻璃电极，其特征在于，所述导电玻璃电极以FJU-200和CdSe作为光活性材料制备得到制备F&C/FTO导电玻璃电极。
10.根据权利要求10所述的导电玻璃电极在制备PEC免疫传感器中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种pec免疫传感器，其特征在于，所述pec免疫传感器以fju-200和cdse作为光活性材料制备f&c/fto导电玻璃电极。
2.一种权利要求1所述的pec免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，（1）中所述的乙酸体积为20~25ml，1,4,5,8-四羧基二酐质量为1.3~1.4g，搅拌时间为10~20min，5-氨基间苯二甲酸质量为1.75~1.85g，回流温度为105℃，用乙醇洗涤ph至7~7.5；所述的hl4粉末质量为22~26mg，dmf体积为4~6ml，无水乙醇体积为0.5~1ml，干燥时间为10~12h；
4.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于，（3）中所述的dmf体积为5-6ml，涡旋时间为1-3min，f&c复合材料在电极表面的滴加体积为40-50µl，干燥时间为10~12h；
5.根据权利要求2所述的用于egfr检测的pec免疫传感器的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的标准溶液稀释后的浓度范围为10fg/ml~100 ng/ml，滴加体积均为10~20µl，孵育条件均为4℃下孵育...
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡爽，赵龙山，海楠，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。