【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、信使rna(mrna)治疗剂是有前途的新治疗剂；例如，mrna疗法可以是传统的蛋白质替代疗法、抗体疗法、疫苗疗法和/或基因疗法的替代方案。在mrna治疗剂中，将编码特定酶、抗体、抗原或其他蛋白质或肽的完整mrna递送至靶细胞，并通过细胞自身的天然翻译机制翻译成完整的酶、抗体、抗原或其他蛋白质或肽。通常使用体外转录系统用酶诸如从模板质粒dna转录mrna的rna聚合酶，随同或随后添加5'-帽和3'-聚腺苷酸化，合成用于此类治疗剂的mrna。此类反应产生组合物，所述组合物同时包含全长mrna和各种不希望的污染物(例如所述反应中使用的蛋白质、盐、缓冲液和非rna核酸)，所述污染物必须除去以提供可用于mrna替代治疗剂的纯净且均质的mrna。
2、传统上，小规模的mrna是通过可商购的基于硅胶的柱系统(诸如qiagen试剂盒)，或者通过蛋白质萃取到有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并且随后进行乙醇沉淀从体外转录反应中纯化而来。这些方法的规模有限，因为它们最多可以提供5至10mg的纯净且均质的mrna；因此，它们不足以满足mrna的临床和商业治疗用途的需求。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种部分基于使用常规流过滤(normal flow filtration)可以有效地将体外合成的mrna纯化至适合于临床或商业治疗用途的纯度的惊人发现的用于大规模纯化体外合成的mrna的改进方法。重要的是，本文所述的常规流过滤方法导致出乎意料高的产率的具有高纯度和完整性的mr
2、如本文所用，术语“常规流过滤”是指其中待纯化的材料沿相对于过滤器表面常规(即垂直)的方向流动的过滤过程。太大而无法通过过滤器的材料得以保留，然而较小的材料通过成为滤液。
3、在一个方面，本专利技术提供了一种纯化信使rna(mrna)的方法，所述方法包括以下步骤：(a)沉淀在包含来自制造所述mrna的一种或多种污染物的组合物中的mrna，以提供包含沉淀的mrna的悬浮液；(b)使包含沉淀的mrna的悬浮液经过过滤器，其中所述沉淀的mrna被过滤器保留；(c)通过洗涤来自步骤(b)的包含保留的沉淀mrna的过滤器来洗涤沉淀的mrna；(d)溶解在步骤(c)中被过滤器保留的沉淀mrna，从而使纯化的mrna通过过滤器；以及(e)从步骤(d)中回收纯化的mrna，其中步骤(b)、(c)和(d)中的每一个步骤均使用常规流过滤进行。
4、在一些实施方案中，制造mrna包括体外转录(ivt)合成。在一些实施方案中，制造mrna包括在合成后对所述mrna进行5'-加帽的步骤。在一些实施方案中，制造mrna不包括对所述mrna进行5'-加帽的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后用5'帽对纯化的mrna进行加帽的步骤。
5、在一些实施方案中，制造mrna包括对mrna进行3'-加尾的步骤。在一些实施方案中，制造mrna不包括对mrna进行3'-加尾的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后对纯化的mrna进行3'加尾的步骤。
6、在一些实施方案中，制造mrna不包括对mrna进行5'-加帽的步骤，并且不包括对mrna进行3'-加尾的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(e)之后用5'帽对纯化的mrna进行加帽和对纯化的mrna进行3'加尾的步骤。
7、在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含酶。在一些实施方案中，所述酶是用于ivt合成mrna的聚合酶。在一些实施方案中，所述酶是加帽酶。在一些实施方案中，所述酶是聚a聚合酶。在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含盐。在一些实施方案中，所述一种或多种污染物包含短的异常终止的转录物。
8、在一些实施方案中，适合用于常规流过滤的过滤器具有实质上小于沉淀的mrna且大于可溶性mrna或污染物的孔径(例如孔直径)或分子量截止(mwco)，使得当可溶性污染物流过时沉淀的mrna可以保留在过滤器上。
9、在一些实施方案中，适合用于本专利技术的过滤器是膜过滤器。在一些实施方案中，膜过滤器具有实质上小于沉淀的mrna且大于可溶性mrna或污染物的分子量截止(mwco)。
10、在一些实施方案中，膜过滤器具有褶状过滤器、缠绕状过滤器或胶囊状过滤器的形式。在一些实施方案中，过滤器包含滤网。
11、在一些实施方案中，适合用于本专利技术的过滤器是深层过滤器。在一些实施方案中，所述深层过滤器具有实质上小于沉淀的mrna且大于可溶性mrna或污染物的孔径或孔直径。
12、在一些实施方案中，过滤器由惰性材料制成。在一些实施方案中，适合用于本专利技术的惰性材料是聚丙烯。在一些实施方案中，惰性材料是改性的聚醚砜(mpes)。在一些实施方案中，惰性材料是聚醚砜(pes)。在一些实施方案中，惰性材料是聚偏二氟乙烯(pvdf)。在一些实施方案中，惰性材料是纤维素。在一些实施方案中，惰性材料是硅藻土。在一些实施方案中，惰性材料是聚四氟乙烯(ptfe)。在一些实施方案中，惰性材料是硝化纤维素。在一些实施方案中，惰性材料是聚乙烯。在一些实施方案中，惰性材料是聚丙烯腈。在一些实施方案中，惰性材料是聚碳酸酯。在一些实施方案中，惰性材料是尼龙。
13、在一些实施方案中，过滤器包含一种或多种三维基质。在一些实施方案中，所述一种或多种三维基质是毡基质。在一些实施方案中，所述毡的厚度为约1毫米(mm)至约1厘米(cm)(例如，约1-500mm、约1-400mm、约1-300mm、约1-200mm、约1-100mm、约1-50mm、约1-40mm、约1-30mm、约1-20mm、约1-10mm、或约1-5mm)。在一些实施方案中，所述毡的厚度在1-10mm之间。在一些实施方案中，所述毡的厚度在1-5mm之间。在一些实施方案中，所述毡的厚度为小于1厘米、小于0.5cm、小于0.4cm、小于0.3cm、小于0.25cm、小于0.2cm、小于0.1cm、小于50mm、小于40mm、小于30mm、小于25mm、小于20mm、小于15mm、小于10mm或小于5mm。在一些实施方案中，过滤器包含至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种三维基质。在一些实施方案中，过滤器包含堆叠的三维基质。
14、在一些实施方案中，过滤器具有有助于保留沉淀的mrna的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有在0.001μm与500μm之间、在0.01μm与200μm之间、或在0.05μm与100μm之间的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有0.05μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有0.5μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有5μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有10μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有20μm或更大的平均孔径。在一些实施方案中，过滤器具有25μm或更大的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的体外转录(IVT)合成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的5’-加帽的步骤。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制造包括所述mRNA的3'-加尾的步骤。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是聚合酶。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述酶是加帽酶。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种污染物包含盐。
9.一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：
10.一种纯化包含通过体外转录(IVT)合成制造的100gm或更多mRNA的组合物的方法，所述方法包括：
【技术特征摘要】
1.一种用于纯化信使rna(mrna)的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述制造包括所述mrna的体外转录(ivt)合成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述制造包括所述mrna的5’-加帽的步骤。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述制造包括所述mrna的3'-加尾的步骤。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·帕莱拉，K·吉利斯，J·阿比萨尔，T·让诺特，E·黑尔德，F·德罗莎，M·希尔特莱，R·鲍威尔，
申请(专利权)人：川斯勒佰尔公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。