【技术实现步骤摘要】
本申请涉及重组病毒载体领域，尤其涉及源自sfv的重组病毒载体系统。
技术介绍
1、基因的递送可以根据递送物质分为dna递送和rna递送。dna的递送通常可以维持递送细胞较长的外源基因表达时间，而rna递送外源基因的表达具有更短的窗口期。对于一些蛋白，例如基因编辑蛋白、转座酶、生长因子等，长期表达存在风险性。以基因编辑蛋白为例，目前普遍认为长期表达基因编辑蛋白可能会提高脱靶效率及引起细胞免疫反应，这是限制基因编辑临床应用最主要的原因之一。利用mrna递送系统递送这类蛋白，能实现在一定窗口期表达蛋白，从而降低风险性，是解决安全性问题的手段之一。目前，能通过递送mrna实现蛋白限时表达的工具可以分为病毒类和非病毒类两种载体，其中应用最为广泛的即为脂纳米颗粒(lnp)递送载体。lnp载体具有很多优点，例如生产成本较低、免疫原性低、能通过静脉给药高效递送至肝脏等。但lnp也存在一定弊端，最大的限制条件即为除了肝脏，其他组织器官递送效率非常低。作为人工合成的化学分子，对lnp进行工程化改造相对困难。虽然有一些报道指出可以通过让lnp装载具有不同靶向的分子，使其靶向不同的组织器官，但很难实现高丰度的装载，因此递送效率也较为有限。病毒具有通过自然选择获得的天然能感染细胞的优势，因此也具有作为基因的递送载体的可能性。
2、sfv是甲病毒属的病毒之一。野生型的sfv病毒结构由囊膜、衣壳蛋白、基因组等组成。决定病毒靶向性的蛋白位于病毒囊膜表面，为e1/e2或e1/e2/e3组成的三聚体；sfv的衣壳通常是由240个c蛋白组成的正二十面体，
3、sfv病毒主要通过受体介导的内吞进入细胞，目前认为介导sfv入侵细胞的受体可能为vldlr/apoer2；进入细胞后，sfv在胞质中释放基因组，开始表达蛋白。由于sfv具有多种器官组织靶向性，尤其是在中枢神经系统中具有感染能力，而作为病毒，其全部生命周期均在胞质中完成，具有较高的安全性，因此可以改造为可能的外源基因递送工具之一。
4、目前对sfv的改造主要为两个方向，一是直接利用重组sfv病毒颗粒，将病毒基因组结构蛋白部分替换为目的基因，形成能在靶细胞中自我复制的rna序列；二是只利用其nsp部分形成自我复制的rna序列，通过lnp等手段进行递送。重组sfv载体被证明具有多种组织器官靶向性，目前的应用主要集中于肿瘤治疗，在基因治疗等其他领域的应用非常少。
技术实现思路
1、本申请提供了一种全新的甲病毒载体，包含所述载体的甲病毒包装载体系统，以及用于分离所述甲病毒的方法。所述甲病毒载体可在本身不表达任何甲病毒蛋白的情况下指导甲病毒包装，并将外源基因核酸序列包装入甲病毒颗粒中。而由于所述载体本身不表达任何甲病毒蛋白，因此具有更低的免疫原性及更高的安全性。同时申请人还在实施例中证实了，利用所述甲病毒载体包装甲病毒颗粒的包装效率不输于其他包含一种或更多种甲病毒蛋白编码序列的甲病毒载体。由所述假病毒载体包装的甲病毒颗粒的感染能力也不劣于由现有技术中包含甲病毒蛋白编码序列的甲病毒载体包装的甲病毒颗粒。并且，所述甲病毒载体包装的甲病毒颗粒，其在体内的表达周期更低，表达峰值达成时间更短，并且由于其可在大脑及中枢神经系统中大量分布，因此可用于中枢神经系统给药。
2、具体的，本申请一方面提供了一种重组甲病毒载体，其从5’至3’端至少依次包含5’utr核酸序列、包装信号核酸序列、外源基因核酸序列及3’utr核酸序列。在一些实施方案中，所述5’utr为可在真核生物中调控rna(例如mrna)翻译的5’utr，例如可在真核细胞中表达外源蛋白的病毒mrna中的5’utr，真核细胞蛋白mrna使用的5’utr等。在一些实施方案中，所述5’utr核酸序列、包装信号核酸序列及3’utr核酸序列源自甲病毒。在一些实施方案中，所述甲病毒为semliki森林脑炎病毒(sfv)。在一些实施方案中，所述5’utr核酸序列包含seq id no：1所示的多核苷酸序列，或与seq id no：1具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，例如82％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％以上序列同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述5’utr核酸序列为seq id no：1所示的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述包装信号核酸序列包含选自seq id no：2、seq id no：3、以及seq id no：4，以及与seq id no：2至4具有80％以上(例如82％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％以上)序列同一性的多核苷酸序列中的任一个或多个。在一些实施方案中，所述包装信号核酸序列从5’至3’端，依次由seq id no：2、seq id no：3、以及seq id no：4连接而成。在一些实施方案中，所述包装信号核酸序列包含seq id no：5所示的多核苷酸序列，或与seq id no：5具有80％以上(例如82％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％以上)序列同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述包装信号核酸序列为seq id no：5所示的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述3’utr核酸序列包含seq id no：6的多核苷酸序列或与seq id no：6具有80％以上(例如82％、84％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％以上)序列同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述3’utr核酸序列如seqid no：6所示。
3、在一些实施方案中，所述重组甲病毒载体为rna，并且其在其3’utr的3’端进一步包含poly a尾。在一些实施方案中，所述poly a尾为哺乳动物蛋白mrna的polya尾。在一些实施方案中，所述poly a尾为β-球蛋白poly a尾。
4、在一些实施方案中，所述重组甲病毒载体为dna，并且其在3’utr的3’端进一步包含poly a加尾信号或poly a尾编码序列，且在5’utr的5’端进一步包含启动子。在一些实施方案中，所述poly a尾为哺乳动物蛋白mrna的polya尾。在一些实施方案中，所述poly a尾为β-球蛋白poly a尾。在一些实施方案中，所述启动子为真核生物启动子。在一些实施方案中，所述启动子为cag启动子。在一些实施方案中，所述cag启动子包含如seq id no：7所示的多核苷酸序列，或与seq id no：7所示的多核苷酸序列如有80％以上(例如82％本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.重组甲病毒载体，其从5’至3’端至少依次包含5’UTR核酸序列、包装信号核酸序列、外源基因核酸序列及3’UTR核酸序列，其中所述5’UTR核酸序列、包装信号核酸序列及3’UTR核酸序列源自甲病毒，优选所述甲病毒为Semliki森林脑炎病毒(SFV)。
2.根据权利要求1的载体，其中所述5’UTR核酸序列包含SEQ ID NO：1所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：1具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列。
3.根据权利要求1的载体，其中所述包装信号核酸序列包含选自SEQ ID NO：2至4及与SEQ ID NO：2至4具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列中的任一个或多个。
4.根据权利要求3的载体，其中所述包装信号核酸序列包含SEQ ID NO：5所示的多核苷酸序列，或与SEQ ID NO：5具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列。
5.根据权利要求1的载体，其中所述3’UTR核酸序列包含SEQ ID NO：6的多核苷酸序列或与SEQ ID NO：6具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列。
6.根据权利要求
7.根据权利要求6的载体，其中所述poly A尾为β-球蛋白poly A尾。
8.根据权利要求1的载体，其为DNA，其在3’UTR的3’端进一步包含poly A加尾信号或poly A尾编码序列，且在5’UTR的5’端进一步包含启动子。
9.重组甲病毒载体系统，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的载体，以及辅助载体，所述辅助载体包含甲病毒结构蛋白和/或非结构蛋白的编码序列，优选包含一个或多个选自甲病毒下述蛋白的编码序列：非结构蛋白(nsp)1、nsp2、nsp3、nsp4、E1、E2、E3、6K及衣壳蛋白(C)，优选所述甲病毒为Semliki森林脑炎病毒(SFV)。
10.纯化Semliki森林脑炎病毒(SFV)的方法，其至少包含密度梯度离心步骤，其使用的密度梯度至少包含一个密度为1.1至1.2g/ml中任意数值的层A，优选为1.105至1.162g/ml中任意数值的层A。
...【技术特征摘要】
1.重组甲病毒载体，其从5’至3’端至少依次包含5’utr核酸序列、包装信号核酸序列、外源基因核酸序列及3’utr核酸序列，其中所述5’utr核酸序列、包装信号核酸序列及3’utr核酸序列源自甲病毒，优选所述甲病毒为semliki森林脑炎病毒(sfv)。
2.根据权利要求1的载体，其中所述5’utr核酸序列包含seq id no：1所示的多核苷酸序列，或与seq id no：1具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列。
3.根据权利要求1的载体，其中所述包装信号核酸序列包含选自seq id no：2至4及与seq id no：2至4具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列中的任一个或多个。
4.根据权利要求3的载体，其中所述包装信号核酸序列包含seq id no：5所示的多核苷酸序列，或与seq id no：5具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列。
5.根据权利要求1的载体，其中所述3’utr核酸序列包含seq id no：6的多核苷酸序列或与seq id no：6具有80％以上序列同一性的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，周琪，韩稼葆，白涵瑜，
申请(专利权)人：北京干细胞与再生医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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