【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、近年来，农药残留导致的环境污染和食品安全问题频频发生。克百威（car）作为一种高效、广谱的杀虫剂，被广泛应用于防治病虫害，保护与促进农作物生长。但其大量使用甚至滥用会导致其在农产品中残留，造成食品安全隐患，危害人体健康。有研究表明，长期接触克百威会导致中枢神经系统受损、肝脏损伤以及免疫抑制等健康问题。而蔬菜是是占据农药市场的主要作物，也是人们日常生活所必需的。近年来，仍有报道指出蔬菜中存在克百威残留超标的现象。因此，除了从源头限制克百威的使用外，快速准确地检测出蔬菜中的克百威残留是保障农作物安全的重要环节。
2、目前，常用于检测蔬菜中car残留的分析方法有物理检测法和免疫检测法。理化检测法包括高效液相色谱法（hplc）、气相色谱-质谱法（gc-ms）和毛细管电泳法等。这些传统分析方法灵敏度高、准确性好，但仪器昂贵、检测成本高、检测时间长。这些特点限制了其在现场检测的应用。免疫检测法主要是酶联免疫吸附法（elisa）和免疫层析技术。其中试剂盒检测时间长，操作复杂。
3、免疫层析技术具有成本低、检测快速、现场实时监测等优点，是最广泛用于car快速检测的方法。
4、在免疫层析试纸条的检测研究中，除了传统的胶体金标记材料外，研究人员还开发了各种具有不同颜色特性的纳米材料作为信号标签，用于新型试纸条的创建。然而，这些单功能材料的灵敏度、准确度和稳定性有限，不能满足复杂样品基质中痕量分析物的检测要求。
5、因此，本研究利用mil-100（fe）基金属有机框架（mof）作为间隔层
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，设计一种基于多功能纳米酶检测克百威的免疫层析试纸条，以解决现有技术中对蔬菜中克百威的残留难以快速检测而影响食品安全的技术问题。
2、本专利技术采取的技术方案如下：一种基于多功能纳米酶检测克百威的免疫层析试纸条，该试纸条包括pvc底板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述样品垫插入含有克百威单克隆抗体标记物的探针溶液中，所述的硝酸纤维素膜上设有包被car-bsa的检测线和包被羊抗鼠igg抗体的质控线。
3、进一步地，所述克百威单克隆抗体标记物中标记物为多功能纳米酶（fe3o4-mof-pt）。
4、 进一步地，所述克百威单克隆抗体标记物的制备过程为：将0.3 mg edc和0.6 mgnhs依次加入1 ml含5 mg fe3o4-mof-pt的pb溶液（0.01 m, ph 7）中。然后将1 ml含有5 μgcar-mab的pb混合。然后将该溶液与1 ml含5 μg car-mab的pb混合，在25℃振荡2 h。随后加入500 μl bsa （3% [w/v]）阻断非特异性结合位点。最后，在11,180×g下离心10 min，重悬于含25%蔗糖、1% bsa的pb中，得到fe3o4-mof-pt-mab探针，并在4℃保存。
5、 进一步地，所述中多功能纳米酶（fe3o4-mof-pt）的制备过程为：将10.5 g—水合柠檬酸完全溶解于100 ml超纯水中。加入500 mg fe3o4纳米粒子，并持续超声30分钟使其分散在上述溶液中。将混合物搅拌４小时后用乙醇洗涤数次，真空干燥得到fe3o4-cooh。
6、 进一步地，将50 mg fe3o4-cooh分散在4 ml fecl3·6h2o的乙醇溶液（10 mm）中，边搅拌边加入4 ml1,3,5-苯三甲酸（h3btc）溶液（10 mm）。混合物在60℃下反应8 h。将产物洗涤3次后在60℃下干燥3小时得到fe3o4-mof。为了制备fe3o4-mof-pt，首先合成了pt纳米颗粒。将10 μl的h2ptcl4·6h2o（10mm）加入到含有450 mg pvp的乙二醇溶液中。将混合物置于110℃的油浴锅中并磁力搅拌3 h，将获得的溶液在氮气保护下储存。随后，将50 mgfe3o4-mof重悬于1 ml上述溶液中，60℃下振摇6 h。将产物洗涤数次，置于真空下干燥，得到fe3o4-mof-pt。
7、上述免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤。
8、 1）样品垫的制备：样品垫预先用缓冲液处理，60℃干燥3 h，备用；所述缓冲液组成为：1.0%bsa（w/v）、1.0%pvp-k30（w/v）、0.05%吐温-20（v/v）的pb溶液。
9、 2）检测线的制备：取car-bsa用0.01m、ph 7的pb定容稀释到0.5mg ml-1做检测线；用划膜仪将其划在硝酸纤维素膜上，形成检测线。
10、 3）质控线的制备：取羊抗鼠igg抗体用0.01m、ph 7的pb定容稀释到0.5mg ml-1做质控线；用划膜仪将其划在硝酸纤维素膜上，形成质控线。
11、 4）将划好的硝酸纤维素膜置于37℃干燥3 h后即得处理的硝酸纤维素膜。
12、 5）将制备好的样品垫、硝酸纤维素膜、底板与吸水垫组装，得到免疫层析试纸条。
13、 进一步地，所述检测线上car-bsa的用量为0.8 μl cm-1，质控线上羊抗鼠igg抗体的用量为0.6 μl cm-1。
14、 本专利技术的有益效果：本专利技术制备得到的多功能纳米酶，将其作为显色剂标记到抗体中，并在3－氨基－9－乙基咔唑（aec）作用下使试纸条在比催化前具有更宽的检测范围（0.25-50 ng ml-1）和较低的检测线0.33 ng ml-1，大大扩宽了免疫层析试纸条的应用检测范围。
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1.一种基于多功能纳米酶检测克百威的免疫层析试纸条，该试纸条包括PVC底板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述样品垫插入含有克百威单克隆抗体标记物的探针溶液中，所述的硝酸纤维素膜上设有包被CAR-BSA的检测线和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述克百威单克隆抗体标记物中标记物为多功能纳米酶（Fe3O4-MOF-Pt）。
3.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述中多功能纳米酶（Fe3O4-MOF-Pt）的制备过程为：将10.5 g一水合柠檬酸完全溶解于100 mL超纯水中。加入500 mgFe3O4纳米粒子，并持续超声30分钟使其分散在上述溶液中。将混合物搅拌４ h后用乙醇洗涤数次，真空干燥得到Fe3O4-COOH。然后将50 mg Fe3O4-COOH分散在4 mL FeCl3·6H2O的乙醇溶液（10 mM）中，边搅拌边加入4 mL1,3,5-苯三甲酸（H3BTC）溶液（10 mM）。混合物在60 ℃下反应8 h。将产物洗涤3
4.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述克百威单克隆抗体标记物的探针制备过程为：将0.3 mg EDC和0.6 mg NHS依次加入1 mL含5 mg Fe3O4-MOF-Pt的PB溶液（0.01 M, pH 7）中。然后将1 mL含有5 μg CAR-mAb的PB混合。然后将该溶液与1 mL含5 μg CAR-mAb的PB混合，在25℃振荡2 h。随后加入500 μL BSA （3% [w/v]）阻断非特异性结合位点。最后，在11,180×g下离心10 min，重悬于含25%蔗糖、1%BSA的PB中，得到Fe3O4-MOF-Pt-mAb探针，并在4℃保存。
5.一种基于多功能纳米酶检测克百威的免疫层析试纸条，包括以下步骤：
6.据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述检测线上CAR-BSA的用量为0.8μLcm-1，质控线上羊抗鼠IgG抗体的用量为0.6μL cm-1。
...【技术特征摘要】
1.一种基于多功能纳米酶检测克百威的免疫层析试纸条，该试纸条包括pvc底板、样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾衔接粘贴在底板上，所述样品垫插入含有克百威单克隆抗体标记物的探针溶液中，所述的硝酸纤维素膜上设有包被car-bsa的检测线和包被羊抗鼠igg抗体的质控线。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述克百威单克隆抗体标记物中标记物为多功能纳米酶（fe3o4-mof-pt）。
3.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述中多功能纳米酶（fe3o4-mof-pt）的制备过程为：将10.5 g一水合柠檬酸完全溶解于100 ml超纯水中。加入500 mgfe3o4纳米粒子，并持续超声30分钟使其分散在上述溶液中。将混合物搅拌４ h后用乙醇洗涤数次，真空干燥得到fe3o4-cooh。然后将50 mg fe3o4-cooh分散在4 ml fecl3·6h2o的乙醇溶液（10 mm）中，边搅拌边加入4 ml1,3,5-苯三甲酸（h3btc）溶液（10 mm）。混合物在60 ℃下反应8 h。将产物洗涤3次后在60℃下干燥3 h得到fe3o4-mof。为了制备fe3o4-mof-pt，首先合成了pt纳米颗粒。将10 μl的h2ptcl4·6...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙霞，郭业民，翟晟西，白梦圆，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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