一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法技术

一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法，是利用原核表达后纯化获得的截断型人重组组织因子结合福氏佐剂免疫小鼠，取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选取ＨＡＴ选择培养基选择性培养筛选，有限稀释法亚克隆培养后，利用ＥＬＩＳＡ法选择目的杂交瘤细胞，大量扩增并注入同系小鼠腹腔内制备腹水，得到效价良好，产量较高的抗人重组组织因子单克隆抗体。本发明专利技术方法制备得到的抗人重组组织因子单克隆抗体灵敏性高、特异性强，可用于人重组组织因子的免疫亲和纯化，还可用于抗凝药物和肿瘤治疗药物的研究开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及。
技术介绍
人组织因子(Tissue Factor, TF)是分子量为47KD的糖蛋白，含有263个氨基酸残基，为跨膜受体蛋白质。TF是凝血因子VII的受体和辅助因子，是外源凝血途径的启动蛋白。TF蛋白分子分为3部分，胞内区21个氨基酸残基，跨膜部分为23个氨基酸残基，具有疏水性，胞外部分含219个氨基酸残基，为氨基端，带有糖链。 组织因子是生理性凝血中最重要的启动因子，是目前临床上凝血酶原时间检测试剂的主要成分，也是影响凝血酶原时间测定的主要因素。近年来的研究还证实，TF不仅在凝血途径中起着重要作用，在各种恶性肿瘤中也常常异常表达，可以通过介导多种信号转导影响肿瘤的生长、侵袭和转移等病理过程。 专利200510012414. 7构建和表达了一种截断型人重组组织因子TF243 (由跨膜部分和膜外部分组成)，同时证明这种缺失胞内区的截断型人重组组织因子具有全部的凝血活性。这种截断型人重组组织因子与生物提取获得的天然组织因子相比，其制备的凝血酶原测定试剂产品质量和测定结果均十分稳定；而与01132127. x专利申请公开的仅包含胞外区的人重组组织因子相比，其生物活性大大提高。 在该专利技术中，利用抗TF单克隆抗体的亲和免疫纯化技术，是获得良好人重组组织因子蛋白的关键。 抗TF单克隆抗体还可与TF发生免疫反应，抑制血栓的形成。同时Huang (Science,1997,275(5229) :547-550.)和Versteeg (Mol Med， 2004， 10 (16) :6.)等的动物模型研究表明TF抗体与TF结合后，可以靶向性抑制肿瘤血管的生成，导致肿瘤坏死。 因此，利用单克隆抗体技术制备灵敏性高、特异性强的抗TF单克隆抗体，不仅能利用免疫亲和方法特异迅速地纯化TF蛋白，为新型凝血酶原测定试剂的生产提供技术保障；还可为利用抗TF单克隆抗体应用于血栓、癌症等临床治疗奠定基础。 而目前国内尚无商品化的抗TF单克隆抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，利用本专利技术方法制备得到的抗人重组组织因子单克隆抗体灵敏性高、特异性强。本专利技术的抗人重组组织因子单克隆抗体是通过以下方法制备得到的 1)选择免疫原利用200510012414. 7专利构建表达的人重组组织因子(rhTF243)作为免疫原，其蛋白特征是含有天然人组织因子跨膜部分和胞外部分的243个氨基酸残基，为缺失胞内区的截断型人重组组织因子，具有天然人组织因子的全部凝血活性。 该人重组组织因子是从人胎盘组织中获取总RNA，设计PCR引物，通过RT-PCR方法得到目的基因片段；将收集的TF基因片段与phoA质粒重组，构建TF表达质粒载体3pTF243，转化到大肠杆菌MM294中，筛选得到基因重组工程菌株，接入发酵培养基发酵表达，最后通过TF单克隆抗体免疫亲和层析柱纯化得到rhTF243，其具体的构建表达方法可参阅200510012414. 7专利。 2)免疫将免疫原稀释成不同浓度的稀释液，与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂乳化混合成不同免疫原浓度的乳化混合液，对小鼠进行基础免疫、加强免疫、二次加强免疫和融合前冲击免疫。 具体的免疫过程为 基础免疫采用30 ii g 60 ii g rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行皮下多点注射免疫； 加强免疫两周后，采用15 g 30 g rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行腹腔注射免疫； 二次加强免疫，加强免疫两周后，采用15 g 30 g rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行二次腹腔注射免疫； 融合前冲击免疫二次加强免疫一周后，采用25 g 50 g rhTF243/ml乳化混合液对小鼠进行腹腔注射冲击免疫。 其中，上述不同浓度的免疫原稀释液与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂均是按照1:1的体积比进行乳化混合的。3)筛选免疫血清采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清； 4)细胞融合及克隆化选取血清效价最高的鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞利用PEG1500试剂进行体外融合，经多次亚克隆获得稳定分泌抗人重组组织因子的杂交瘤细胞株； 5)制备腹水将杂交瘤细胞株扩大培养后，注入经液体石蜡预处理的小鼠腹腔内生产腹水； 制备腹水的条件是以液体石蜡作为致敏剂，选取14 22周龄BALB/c小鼠为实验动物，以0. 5ml/只注射液体石蜡，以1 X 105 5X 105个/ml的接种密度接种杂交瘤细胞株O. 5ml/只。 6)收集腹水接种杂交瘤细胞株10 12d后，将腹水迅速吸至细胞离心管中，3000rpm离心15min，收集上清液，得到效价良好，产量较高的抗人重组组织因子单克隆抗体。 与现有技术相比，本专利技术具有的优势是 1)采用具有天然人组织因子的全部凝血活性的人重组组织因子作为抗原，筛选获得的抗组织因子单克隆抗体特异性高； 2)优化了腹水的制备方法，扩大培养后的细胞株注入经液体石蜡预处理的小鼠腹腔以生产腹水，大大提高了腹水的产率。 3)依本专利技术方法制得的单克隆抗体，可用于研究开发抗凝药物和肿瘤治疗药物，质量稳定，产量高，可用于产业化和商业化。附图说明 图1为抗人重组组织因子单克隆抗体的SDS-PAGE分析结果；4 图中，1、2为纯化的抗人重组组织因子单克隆抗体，3为标准蛋白质分子量。 图2为抗人重组组织因子单克隆抗体的蛋白免疫印迹(Wester Blot)分析结果； 图中，M为标准蛋白质分子量，l、2、3为截断型人重组组织因子rhTF^，4为纯化的抗人重组织组织因子单克隆抗体。具体实施方式 实施例1 抗人重组组织因子单克隆抗体的制备 1、免疫原 选择200510012414. 7专利构建表达的人重组组织因子(rhTF243)作为免疫原。 2、免疫小鼠 基础免疫取储存于Tris-HCl缓冲液中的rhTF243 (lmg/ml)稀释至120 y g/ml，按照l : 1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠腹部，选取5个点对小鼠进行皮下注射免疫，注射量0. 5ml/只。免疫量0. 5ml， 30 y grhTF243/只，注射完毕后用酒精棉球消毒注射部位，防止感染。 加强免疫两周后，取储存于缓冲液中的rhTF^稀释至60iig/ml，按照l : 1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠右腹部，吸取乳化液进行腹腔注射免疫，免疫量0. 5ml， 15 ii g rhTF243/只，注射完毕后用酒精棉球消毒注射部位，防止感染。 二次加强免疫两周后，取储存于缓冲液中的rhTF^稀释至60iig/ml，按照l : 1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠右腹部，吸取乳化液进行腹腔注射免疫，免疫量0. 5ml， 15 ii g rhTF243/只，注射完毕后用酒精棉球消毒注射部位，防止感染。 融合前冲击免疫二次加强免疫一周后，取储存于缓冲液中的rhTF^，稀释至100yg/ml，按照1 : 1的体积比与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂充分乳化混合，以酒精棉球消毒BALB/c小鼠右旗部，吸取乳化液进行腹腔注射免疫，免疫量0. 5ml，25ii g rhTF243/只，注射完毕后用酒精棉球消毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人重组组织因子单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：　　１）选择免疫原：选择缺失胞内区的截断型人重组组织因子ｒｈＴＦ↓［２４３］作为免疫原，该截断型人重组组织因子含有天然人组织因子跨膜部分和胞外部分的２４３个氨基酸残基；　　２）免疫：将免疫原稀释成不同浓度的稀释液，与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂乳化混合成不同免疫原浓度的乳化混合液，对小鼠进行基础免疫、加强免疫、二次加强免疫和融合前冲击免疫；　　３）筛选免疫血清：采用酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；　　４）细胞融合及克隆化：选取血清效价最高的鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞进行体外融合，经多次亚克隆获得稳定分泌抗人重组组织因子的杂交瘤细胞株；　　５）制备腹水：将杂交瘤细胞株扩大培养后，注入经液体石蜡预处理的小鼠腹腔内生产腹水；　　６）收集腹水：接种杂交瘤细胞株１０～１２ｄ后，将腹水迅速吸至细胞离心管中，３０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ，得到抗人重组组织因子单克隆抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵邑，赵峰梅，潘薇薇，何永吉，齐延红，梁雅丽，卢晓霞，
申请(专利权)人：山西省生物研究所，太原博奥特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：14[中国|山西]