【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物生物合成领域，具体而言，涉及一种nedosiran的制备方法。
技术介绍
1、在现有技术中，由基因表达及突变引起的疾病无法被传统的小分子药物治愈，这类疾病只能通过基因表达干预进行治疗。sirna是长度为19-25nt的双链rna寡核苷酸，可特异性结合同靶基因的mrna，通过阻止翻译的进程，从而达到阻碍靶基因的表达效果，即通过介导rna干扰引起基因沉默。sirna药物的研发给基因治疗带来巨大的发展前景，现已被广泛应用于疾病的治疗领域中。sirna作用于mrna，可成药的靶点要显著大于作用位点是蛋白质的传统小分子药物，且可以通过变换序列而作用于新的靶点。对基因表达进行干预。
2、nedosiran是一种基因靶向治疗sirna类双链rna药物，由dicerna公司研发，可用于治疗原发性高草酸尿症（primary hyperoxaluria，ph）。nedosiran适应症包括3种类型的原发性高尿酸症（ph1、ph2、ph3），是目前唯一一款可同时治疗3种ph的在研药物。
3、nedosiran的合成方法主要使用化学固相合成法进行制备，在合成方法中使用固相载体，通过亚磷酰胺三酯法循环合成，合成循环结束后，通过氨解将nedosiran链从固相载体切除，再经过纯化获得目标产品。此制备方法中产品合成的收率随着合成链长的增加而降低，在合成的过程产生的杂质如，比目标序列多一个核苷酸的杂质（n+1杂质）或比目标序列少一个核苷酸的杂质（n-1杂质）也会随着合成链长的增加而增多，不易去除，导致纯化过程复杂，效率
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种nedosiran制备方法，以解决现有技术中制备nedosiran纯度较低的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种nedosiran的制备方法，该nedosiran为由互补配对的正义链和反义链组成的双链sirna；该制备方法包括：
3、将正义链底物片段、反义链底物片段和rna连接酶混合，其中，正义链底物片段能够组成正义链，反义链底物片段能够组成反义链；正义链底物片段和反义链底物片段以碱基互补形成的氢键连接，正义链底物片段和反义链底物片段的头尾碱基之间均未互相连接，形成含有缺刻的双链核苷酸结构；利用rna连接酶将缺刻两端的碱基以磷酸二酯键连接，形成nedosiran；缺刻两端的碱基分别为不同底物片段的5’端和3’端，5’端为磷酸根，3’端为羟基；利用rna连接酶连接缺刻上下游的5’端的磷酸根和3’端的羟基，形成磷酸二酯键，获得nedosiran；rna连接酶为具有seq id no：1所示的氨基酸序列的rna连接酶；或与seq id no：1所示的rna连接酶具有70%以上同一性，且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶。
4、进一步地，正义链的核苷酸序列为seq id no：19所示的核苷酸序列，反义链的核苷酸序列为seq id no：20所示的核苷酸序列。
5、进一步地，正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；优选地，正义链底物片段的长度为2-34nt，更优选为6-30nt；优选地，反义链底物片段的长度为2-20nt，更优选为6-16nt。
6、进一步地，正义链底物片段和反义链底物片段均包括2条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段。制备方法包括：将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第一反义链底物片段和第二反义链底物片段混合，在rna连接酶的催化作用下，第一正义链底物片段和第二正义链底物片段连接形成正义链，催化第一反义链底物片段和第二反义链底物片段连接形成反义链，正义链和反义链通过碱基互补配对形成nedosiran；优选地，将正义链底物片段和反义链底物片段退火后与rna连接酶混合，获得nedosiran。
7、进一步地，第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：5所示的核苷酸序列，第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：6所示的核苷酸序列；第一反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：8所示的核苷酸序列，第二反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：7序列所示的核苷酸序列；优选地，第一正义链底物片段的核苷酸序列seq idno：9所示的核苷酸序列，第二正义链底物片段的核苷酸序列seq id no：10序列所示的核苷酸序列；第一反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：12所示的核苷酸序列，第二反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：11所示的核苷酸序列。
8、进一步地，第一正义链底物片段的3’端与第二正义链底物片段的5’端在rna连接酶的催化下连接，形成正义链；第一反义链底物片段的3’端与第二反义链底物片段的5’端在rna连接酶的催化下连接，形成反义链；优选地，第一正义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二正义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为r基团；优选地，第一反义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二反义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。
9、进一步地，正义链底物片段和反义链底物片段均包括3条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段、第二正义链底物片段和第三正义链底物片段；反义链底物片段包括第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和第三反义链底物片段；优选地，制备方法包括：将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第三正义链底物片段、第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和第三反义链底物片段混合，在rna连接酶的催化作用下，第一正义链底物片段、第二正义链底物片段和第三正义链底物片段连接形成正义链，催化第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和第三反义链底物片段连接形成反义链，正义链和反义链通过碱基互补配对形成nedosiran；优选地，将正义链底物片段和反义链底物片段退火后与rna连接酶混合，获得nedosiran。
10、进一步地，第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：13所示的核苷酸序列；第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：14所示的核苷酸序列；第三正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：15所示的核苷酸序列；优选地，第一反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：18所示的核苷酸序列；第二反义链底物片段的核苷酸序列为seqid no：17所示的核苷酸序列；第三反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：16所示的核苷酸序列。
11、进一步地，正义链底物片段及反义链底物片段浓度各自独立选自0.1-4.5mm；优选地，正义链底物片段、反义链底物片段和rna连接酶混合形成的反应体系中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Nedosiran的制备方法，其特征在于，所述Nedosiran为由互补配对的正义链和反义链组成的双链siRNA；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链的核苷酸序列为SEQ IDNO：19所示的核苷酸序列，所述反义链的核苷酸序列为SEQ ID NO：20所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括2条，所述正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，所述反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列；
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列SE
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的3’端与所述第二正义链底物片段的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述正义链；所述第一反义链底物片段的3’端与所述第二反义链底物片段的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述反义链。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；所述第二正义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为R基团；
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括3条，
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将所述第一正义链底物片段、所述第二正义链底物片段、所述第三正义链底物片段、所述第一反义链底物片段、所述第二反义链底物片段和所述第三反义链底物片段混合，在所述RNA连接酶的催化作用下，所述第一正义链底物片段、所述第二正义链底物片段和所述第三正义链底物片段连接形成所述正义链，催化所述第一反义链底物片段、所述第二反义链底物片段和所述第三反义链底物片段连接形成所述反义链，所述正义链和所述反义链通过碱基互补配对形成所述Nedosiran。
11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段为SEQ IDNO：13所示的核苷酸序列；
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段及所述反义链底物片段浓度各自独立选自0.1-4.5mM；
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的反应温度为10-40℃；
...【技术特征摘要】
1.一种nedosiran的制备方法，其特征在于，所述nedosiran为由互补配对的正义链和反义链组成的双链sirna；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链的核苷酸序列为seq idno：19所示的核苷酸序列，所述反义链的核苷酸序列为seq id no：20所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括2条，所述正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，所述反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段；
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：5所示的核苷酸序列，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq idno：6所示的核苷酸序列；
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列seq id no：9所示的核苷酸序列，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列seq id no：10序列所示的核苷酸序列；
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的3’端与所述第二正义链底物片段的5’端在所述rna连接酶的催化下连接，形成所述正义...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，张娜，焦学成，王磊，冯骏晨，张冉冉，胡守俊，蒋相军，陈仁芳，贾旭，李少贺，王吉忠，严思堂，金星，刘永贤，王思源，傅绪飞，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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