【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，涉及免疫监测与医学成像，具体涉及一种分子胶门控的异位胸腺模型及其制备和评估方法。
技术介绍
1、传统药物疗法伴随毒副作用，且作用机制难以评估，只能从病理指标判断。细胞疗法通过自体/异体细胞治疗患者，具有疗效持久，可特异性编程等优势，但具有脱靶毒性和在体难调控问题。类器官是在体内/外发育成类似器官的多细胞结构，研究证实其可代偿机体受损器官的功能。
2、狼疮是一种常见的自身免疫性疾病，由多种基因和环境因素介导，常累及多组织系统与器官，尚无法根治。狼疮患者胸腺表现皮质萎缩和髓质紊乱。工程化免疫细胞治疗是狼疮临床管理的先进策略。研究表明小鼠通过移植同种异体的健康胸腺细胞或者类器官，可重建其免疫功能并缓解病情，但存在类器官常引发i型干扰素等炎症性细胞因子爆发以及基因沉默从而导致有效性短的挑战性科学难题。
3、工程化细胞通过基因工程、分子工程方法使得细胞编程重置，为细胞移植以及类器官策略转化提供一种解决方案。例如，沙利度胺类似物分子胶可以通过与e3泛素连接酶底物crbn蛋白反应形成复合物，使得i型干扰素合成通路转录因子ikzf3蛋白降解，将有效地降低i型干扰素释放水平并且阻断基因沉默进程，有望改善复杂疾病预后的目标。然而，小鼠crbn蛋白与分子胶不发生上述反应。监测在体泛素酶介导的转录因子复合物所需分辨率在一维空间域小于100纳米，在时间域上限低于数分钟，导致单细胞空间分辨率标注的靶标分子复合物形成与降解动态过程难以准确监测。目前，常用的分子胶监测手段是基于分子间亲和力和量效关系如ic50、ec5
技术实现思路
1、基于此，本专利技术提出了一种分子胶门控的异位胸腺发生及膨胀显微成像监测平台，通过分子胶门控的工程化细胞解决胸腺类器官失效和毒性体内调控问题，实现体内调控。
2、根据本专利技术的第一方面，提供了一种分子胶门控的异位胸腺模型，包括表面表达nox2复合物、t细胞表面死亡受体fas，胞内表达人源化crbn蛋白的工程化细胞；
3、所述工程化细胞用于通过分子胶药物与crbn蛋白反应靶向降解转录因子，抑制i型干扰素合成和炎症风暴。
4、根据本专利技术的实施例，所述工程化细胞通过小分子药物干预的异位类器官得到；
5、其中，所述异位类器官通过将野生型b6小鼠的细胞输入疾病模型小鼠皮下淋巴结获得。
6、根据本专利技术的实施例，所述疾病模型小鼠为通过小鼠交叉繁育获得的b6.faslpr.ncf1m1j.lyz2akaluc.crbni391v的受体疾病模型小鼠。
7、根据本专利技术的第二方面，提供了一种上述的分子胶门控的异位胸腺模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
8、通过小鼠交叉繁育的方法，建立疾病模型；
9、利用由野生型b6小鼠的细胞输入疾病模型小鼠皮下淋巴结的方法，构建异位类器官；
10、利用小分子药物干预的方法，构建得到分子胶门控的异位胸腺模型。
11、根据本专利技术的实施例，所述通过小鼠交叉繁育的方法，建立疾病模型包括：
12、通过杂交不同品系的小鼠，获得构建基因型标记为b6.faslpr.ncf1m1j.lyz2akaluc.crbni391v的受体疾病模型小鼠。
13、根据本专利技术的实施例，所述利用由野生型b6小鼠的细胞输入疾病模型小鼠皮下淋巴结的方法，构建异位类器官包括：
14、向b6.faslpr.ncf1m1j.lyz2akaluc.crbni391v受体小鼠移植野生型b6供体小鼠胸腺细胞，构建异位类器官。
15、根据本专利技术的实施例，所述利用小分子药物干预的方法，构建得到分子胶门控的异位胸腺模型包括：
16、向所述异位类器官内注射分子胶物质，构建得到分子胶门控的异位胸腺模型；
17、其中，所述分子胶物质为沙利度胺类似物；
18、所述分子胶物质用于通过与e3泛素连接酶底物受体crbn蛋白反应形成复合物，结合并靶向降解转录因子。
19、根据本专利技术的第三方面，提供了一种上述的分子胶门控的异位胸腺模型的评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
20、取已构建权利要求1-3任一所述的异位胸腺模型的受体小鼠；
21、获取所述受体小鼠的类器官胸腺、宿主小鼠胸腺、肾脏、心脏、肺、主动脉、血清，制成样品切片；
22、将所述样品切片与膨胀单体溶液在4℃下0.1毫米厚度凝胶室内进行第一次孵育；
23、将第一次孵育后的所述样品切片在匀浆缓冲液中进行第二次孵育；
24、将所述第二次孵育后的所述样品切片膨胀并进行空间多组学染色，得到观测切片；
25、获取所述观测切片的包含分子胶药物、crbn蛋白、转录因子亚细胞位置、复合物分子结构和相对位置的图像数据；
26、通过所述图像数据分析得到类器官功能代偿效果。
27、根据本专利技术的实施例，所述膨胀单体溶液包括：二甲基丙烯酰胺，丙烯酸钠，丙烯酰胺，n,n-亚甲基双丙烯酰胺，氯化钠，溶于pbs中保存，使用前加入过硫酸铵，四甲基乙二胺，4-羟基他莫昔芬和甲基丙烯醛；
28、所述匀浆缓冲液中含有十二烷基硫酸钠和尿素。
29、根据本专利技术的实施例，所述将所述第二次孵育后的所述样品切片膨胀并进行空间多组学染色，得到观测切片包括：
30、将将所述第二次孵育后的所述样品切片修剪到合适的形状，然后用封闭液室温下处理一小时；
31、用pbs清洗3次后分子胶作用下游转录因子蛋白如ikzf3抗体等和细胞内脂质染色试剂(如线粒体染色)、核酸染色试剂等感兴趣生物分子靶向试剂染色；
32、用hoechest33258染料室温下30分钟染色细胞核，pbs清洗；
33、在避光条件下用双蒸水室温下浸泡使所述样品切片充分膨胀，得到观测切片。
34、从上述技术方案可以看出，本专利技术提供的分子胶门控的异位胸腺模型及其制备和评估方法具有以下有益效果：
35、本专利技术采用基小鼠交叉繁育手段构建一种表面表达nox2复合物、t细胞表面死亡受体fas，胞内表达人源化crbn蛋白的工程化细胞。在工程化细胞在体发育为胸腺类器官过程中，针对炎症风暴、基因沉默等常见现象，可通过分子胶药物与crbn蛋白反应靶向降解转录因子，从而抑制i型干扰素合成和炎症风暴，阻断基因沉默进程，维持效果。
36、本专利技术采用基于甲基丙烯醛的膨胀显微技术，结合空间蛋白成像，脂质成像和转录本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种分子胶门控的异位胸腺模型，其特征在于，包括细胞表面表达NOX2复合物、T细胞表面死亡受体FAS，胞内表达人源化CRBN蛋白的工程化细胞；
2.根据权利要求1所述的异位胸腺模型，其特征在于，所述工程化细胞通过小分子药物干预的异位类器官得到；
3.根据权利要求2所述的异位胸腺模型，其特征在于，所述疾病模型小鼠为通过小鼠交叉繁育获得的B6.Faslpr.Ncf1m1J.Lyz2Akaluc.CrbnI391V的受体疾病模型小鼠。
4.一种根据权利要求1-3任一所述的分子胶门控的异位胸腺模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通过小鼠交叉繁育的方法，建立疾病模型包括：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述利用由野生型B6小鼠的细胞输入疾病模型小鼠皮下淋巴结的方法，构建异位类器官包括：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用小分子药物干预的方法，构建得到分子胶门控的异位胸腺模型包括：
8.一种根据权利要求1-3任一所述的分子胶门
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述膨胀单体溶液包括：二甲基丙烯酰胺(4％v/v)，丙烯酸钠(30％w/v)，丙烯酰胺(10％w/v)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.01％w/v)，氯化钠(1％w/v)，溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中保存。使用前加入过硫酸铵(0.25％w/v)，四甲基乙二胺(0.04％v/v)，4-羟基他莫昔芬(0.001％w/v)和甲基丙烯醛(0.1％v/v)，每个样本预计使用200微升；
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述将所述第二次孵育后的所述样品切片膨胀并进行空间多组学染色，得到观测切片包括：
...【技术特征摘要】
1.一种分子胶门控的异位胸腺模型，其特征在于，包括细胞表面表达nox2复合物、t细胞表面死亡受体fas，胞内表达人源化crbn蛋白的工程化细胞；
2.根据权利要求1所述的异位胸腺模型，其特征在于，所述工程化细胞通过小分子药物干预的异位类器官得到；
3.根据权利要求2所述的异位胸腺模型，其特征在于，所述疾病模型小鼠为通过小鼠交叉繁育获得的b6.faslpr.ncf1m1j.lyz2akaluc.crbni391v的受体疾病模型小鼠。
4.一种根据权利要求1-3任一所述的分子胶门控的异位胸腺模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述通过小鼠交叉繁育的方法，建立疾病模型包括：
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述利用由野生型b6小鼠的细胞输入疾病模型小鼠皮下淋巴结的方法，构建异位类器官包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟江宏，韩志成，岳杭琪，陈重衡，朱卫彬，
申请(专利权)人：北京航空航天大学，
类型：发明
国别省市：
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