【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物成像，涉及一种lrrk2激酶的相变探针及其应用，尤其涉及lrrk2激酶的相变探针在高内涵筛选中的应用。
技术介绍
1、帕金森病（parkinson′s disease，pd）是第二常见的神经系统退行性疾病，世界范围内65岁以上人群患病率为1.7%。通过遗传学研究发现，在帕金森患者中有100多个lrrk2基因突变，lrrk2基因突变携带者占家族性帕金森病患者的4%-10%，占散发性帕金森病患者的1%-2%，其中仅lrrk2-g2019s突变携带者即占帕金森总患病人群的约1%。此外，lrrk2基因突变也是免疫性肠炎克罗恩病（crohn's disease，cd）的重要风险因素。大多数致病的lrrk2基因突变会增加lrrk2的激酶活性。并且，在散发性帕金森病逝者脑片病理研究中还发现，即便患者并未携带lrrk2基因突变，野生型lrrk2激酶活性也异常增高。因此，lrrk2激酶活性抑制剂非常有希望成为帕金森病病程的治疗靶点。
2、目前，全球多家药企已开发100多种靶向lrrk2激酶的抑制剂，快速检测lrrk2激酶活性、寻找lrrk2激酶的抑制剂作为治疗帕金森病的药物有广阔市场前景。目前，主要通过蛋白质免疫印迹或免疫荧光方法检测lrrk2自身和底物的磷酸化水平来指示lrrk2激酶活性，该方法操作繁琐，花费时间长，依赖于抗体质量，重复性差，可靠性不高，不易进行高通量筛选。
技术实现思路
1、本专利技术针对上述现有技术存在的不足，提供一种lrrk2激酶的相变探针及其应
2、具体技术方案如下：
3、本专利技术的目的之一是提供一种lrrk2激酶的相变探针，依次包括编码以下蛋白质或肽段的dna序列：rab10、荧光蛋白、hotag3、rilpl2、荧光蛋白、hotag6；
4、其中，编码hotag3的dna序列如seq id no.5所示；
5、其中，编码hotag6的dna序列如seq id no.8所示。
6、其中，rab10为lrrk2激酶的底物，编码rab10（野生型，rab10-wt）的dna序列优选包括如seq id no.1所示的序列。
7、其中，rilpl2为rab10第73位点苏氨酸（thr）磷酸化修饰后的特异性结合蛋白，编码rilpl2（野生型，rilpl2-wt）的dna序列优选包括如seq id no.7所示的序列。
8、其中，所述的荧光蛋白优选为绿色荧光蛋白egfp；编码egfp的dna序列如seq idno.3所示。
9、本专利技术的机理如下：
10、lrrk2激酶能磷酸化一系列rab gtpase蛋白，其中代表性底物rab10的第73位点苏氨酸（thr73）被lrrk2磷酸化后，磷酸化形式的rab10（phospho-thr73-rab10）与rilpl2蛋白特异性结合；相比之下，非磷酸化形式的rab10则完全不能与rilpl2结合。
11、根据这一特性，本专利技术设计rab10和rilpl2分别连接寡聚化的肽段hotag3（homo-oligomeric tag 3，疏水性肽段，在细胞内形成六聚体）和hotag6（疏水性肽段，在细胞内形成四聚体），构建rab10-egfp-hotag3和rilpl2-egfp-hotag6。同时将两者用自剪切短肽t2a连接，以保证两者的蛋白表达量摩尔比是1:1。六聚体的rab10-egfp被lrrk2激酶磷酸化后，与四聚体的rilpl2-egfp特异性结合，两者不对称结合，富余的单体将招募相邻的寡聚体从而引发相变，最终形成直径约2μm的相变液滴。lrrk2激酶活性检测转变为绿色相变液滴个数或总荧光强度检测，在便于检测的同时，极大提高了lrrk2激酶活性的检测灵敏度，实现了lrrk2激酶活性在活细胞系统的可视化。本专利技术的探针可以在荧光显微镜下记录结果并可应用高内涵软件（优选thermo scientific hcs studio：cellomics scan version6.6.3）进行自动化定量。经各种突变对照组和lrrk2抑制剂处理组的实验证实，本专利技术的探针具有特异性。
12、本专利技术中，lrrk2激酶磷酸化底物rab10第73位点苏氨酸（thr73）后，磷酸化修饰的rab10能够特异性结合rilpl2为关键，因此磷酸化后的rab10与rilpl2相互作用程度反应了lrrk2激酶活性，进而表征为探针形成的绿色液滴个数或总荧光强度，从而实现lrrk2激酶活性在活细胞系统的可视化。
13、优选地，hotag3与rilpl2之间还包括自剪切短肽t2a 。t2a保证真核表达质粒在细胞内翻译成两个完整的部分并保证蛋白表达量摩尔比是1：1。编码t2a的dna序列优选包括如seq id no.6所示的序列。seq id no.6为不包括酶切位点的序列，包括酶切位点编码t2a的dna序列优选如seq id no.11所示。
14、优选地，本专利技术的相变探针还包括编码linker的dna序列。各种linker在6-30个柔性氨基酸（不包括酶切位点）范围内，便于该探针工作。
15、进一步优选，所述的linker包括linker1和linker2。
16、其中， rab10与第一荧光蛋白之间、以及rilpl2与第二荧光蛋白之间优选连接有linker1，第一荧光蛋白与hotag3之间、以及第二荧光蛋白与hotag6之间优选连接有linker2。
17、具体地，相变探针依次包括编码以下蛋白质或肽段的dna序列：rab10-linker1-egfp-linker2-hotag3-t2a-rilpl2-linker1-egfp-linker2-hotag6。
18、其中，编码linker1的dna序列包括如seq id no.2所示的序列；seq id no.2为不包括酶切位点的序列，包括酶切位点编码linker1的dna序列优选如seq id no.9所示。
19、其中，编码linker2的dna序列包括如seq id no.4所示的序列；seq id no.4为不包括酶切位点的序列，包括酶切位点编码linker2的dna序列优选如seq id no.10所示。
20、本专利技术的目的之二是提供上述相变探针在检测lrrk2激酶活性中的应用。
21、具体地，可采用如下方法检测lrrk2激酶活性：可将相变探针克隆至真核表达载体（优选为pcdna3.1质粒），与克隆有lrrk2激酶基因的质粒共同转染入细胞，即可相变形成绿色液滴。可用绿色相变液滴总数/细胞总数显示lrrk2激酶的激活程度。细胞总数用核定位3nls-mcherry的探针指示。
22、本专利技术的目的之三是提供上述相变探针在lrrk2激酶抑制剂筛本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种LRRK2激酶的相变探针，其特征在于，依次包括编码以下蛋白质或肽段的DNA序列：Rab10、荧光蛋白、HOTag3、RILPL2、荧光蛋白、HOTag6；
2.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，编码Rab10的DNA序列包括如SEQ IDNO.1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，编码RILPL2的DNA序列包括如SEQ IDNO.7所示的序列。
4.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，所述荧光蛋白为eGFP；
5.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，HOTag3与RILPL2之间还包括T2A；
6.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，还包括编码Linker的DNA序列。
7.根据权利要求6所述的相变探针，其特征在于，
8.根据权利要求7所述的相变探针，其特征在于，
9.一种如权利要求1-8任一项所述的相变探针在检测LRRK2激酶活性中的应用。
10.一种如权利要求1-8任一项所述的相变探针在LRRK2激酶抑制剂筛选
...【技术特征摘要】
1.一种lrrk2激酶的相变探针，其特征在于，依次包括编码以下蛋白质或肽段的dna序列：rab10、荧光蛋白、hotag3、rilpl2、荧光蛋白、hotag6；
2.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，编码rab10的dna序列包括如seq idno.1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，编码rilpl2的dna序列包括如seq idno.7所示的序列。
4.根据权利要求1所述的相变探针，其特征在于，所述荧光蛋白为egfp；
【专利技术属性】
技术研发人员：吴军兵，张树远，黄文祥，纪晓晗，张颖，
申请(专利权)人：山东博观成像生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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