【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种乌枣参肽及其制备方法和应用。
技术介绍
1、生物活性肽是一些具有特殊生理调节功能的低分子聚合物，是某些药品或功能食品的重要有效成分，与蛋白质相比，活性肽具有分子量小、稳定性高和利于吸收等优点。
2、生物分子的氧化是生物体内普遍存在的反应，这会导致大量自由基释放，这些自由基具有很强的活性，这会破坏体内电子的平衡，过量的自由基会导致许多疾病的发生。而具备抗氧化特性的天然活性肽可以作为营养补充剂和氧化应激处理中的天然抗氧化剂使用。
3、近年来，随着海洋资源的不断开发，海洋生物资源也大量地被列入研究行列中，海洋资源成为了新能源开发不可或缺的一部分。人们在对海洋生物的研究中，不断地从海洋生物中发现一些具有抗氧化活性的化合物，多糖、蛋白质、多肽乃至氨基酸都出现不同程度的抗氧化活性。海洋生物抗氧化物质可通过各种途径清除内源性和外源性自由基，具有抗氧化作用强、种类多、结构复杂、副作用低等特点。从海洋生物中寻找新的天然抗氧化活性物质、新的抗衰老药物已成为海洋药物研究的重要目标之一。目前，海洋来源的抗氧化活性肽多来自藻类和鱼类，乌枣参(乌皱辐肛参)是常见的食用海参，当下鲜有以乌枣参为原料制备抗氧化肽的研究。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种乌枣参肽及其制备方法和应用，其以乌枣参为原料，获得乌枣参肽的氨基酸序列，且制备的乌枣参肽具有良好的抗氧化作用。
2、为达到上述目的，本专利技术公开了一种乌枣参肽，其选自以下任一种或两种
3、本专利技术还公开了上述乌枣参肽的制备方法，其包括以下步骤：
4、s1、酶解
5、以乌枣参为原料，利用碱性蛋白酶和风味酶对乌枣参进行酶解，酶解结束后灭酶，经离心后，收集上清液并冻干，得到乌枣参酶解物粉末；
6、s2、第一次分离纯化
7、将步骤s1得到的乌枣参酶解物粉末配制呈溶液并过滤，然后采用葡聚糖凝胶色谱法分离纯化滤液并洗脱，收集洗脱液中的各组分并冻干；
8、s3、预筛选
9、对步骤s2得到的洗脱液各组分进行抗氧化活性测试，筛选出抗氧化活性高的组分；
10、s4、第二次分离纯化
11、对步骤s3筛选出的组分进行rp-hplc分离纯化，筛选出峰型对称且响应值高的组分并冻干备用；
12、s5、序列鉴定
13、对步骤s4筛选出的组分进行质谱测定，质谱测定的结果采用质谱分析软件分析，获得多条不重复多肽序列；
14、s6、虚拟筛选
15、利用生物学信息学工具从步骤s5获得的多肽序列中筛选出具有高抗氧化活性的寡肽；
16、s7、多肽合成
17、将步骤s6筛选出的寡肽进行固相合成，即得所述乌枣参肽。
18、优选地，步骤s1中，在酶解前，先将干乌枣参用0.025mol/l柠檬酸水溶液浸泡16～24h，然后取出并置于80～95℃的纯净水中加热60～120min，之后再将乌枣参切块或绞成肉糜；
19、乌枣参的酶解做法为：将乌枣参块或肉糜放入酶解罐中，然后加入纯净水、胰酶、胶原酶和碱性蛋白酶，纯净水、胰酶、胶原酶和碱性蛋白酶的添加量分别为干乌枣参重量的500％、0.5％、0.3％和0.2％，调节ph至8.0，并于55℃酶解2h；然后在酶解液中加入干乌枣参重量的0.5％的木瓜蛋白酶，调节ph至7.0，继续酶解2h；
20、酶解结束后，于100℃温度下灭酶10min，获得酶解液；灭酶结束后，将获得的酶解液通过50nm陶瓷膜过滤并收集透析液，然后采用反渗透膜过滤并收集浓缩液，冻干后即得乌枣参酶解物粉末。
21、优选地，步骤s2具体为：将乌枣参酶解物粉末配制成10mg/ml溶液，过0.45μm滤膜；利用sephadex g-15凝胶柱分离，上样量为3ml，设置流速为0.5ml/min，每4min收集1管，以超纯水进行洗脱，用紫外分光光度计于214nm波长处检测吸光值；收集洗脱液各组分并冻干组分。
22、优选地，步骤s3中，抗氧化活性测试包括体外抗氧化活性测试和以线虫为模型的体内抗氧化活性测试。
23、优选地，步骤s4中，rp-hplc分离纯化具体为：将步骤s3筛选出的组分用超纯水溶解并配制成5mg/ml溶液，经0.22μm膜过滤后，利用配备有unisil c18-bp色谱柱的制备型反相高效液相色谱仪对样品进一步纯化；洗脱液分别为含0.1％质量浓度的三氟乙酸的超纯水和含0.1％质量浓度的三氟乙酸的乙腈，流速保持在0.5ml/min，进样体积为100μl，检测波长为214nm；然后按照以下梯度进行洗脱：0～60min，100～60％的含0.1％质量浓度的三氟乙酸的超纯水。
24、优选地，步骤s5具体为：将步骤s4筛选出的组分的水溶液进行离心，获得的上清液通过lc-ms/ms的正离子扫描模式进行分析；流动相由a组分和b组分组成，a组分为含0.1％质量浓度的甲酸的超纯水，b组分为含0.1％质量浓度的甲酸的乙腈，进样体积为10μl，流速为0.25ml/min；梯度洗脱程序如下：0～2min，2％b；2～40min，2～28％b；40～50min，28～40％b；50～52min，40～90％b；52～56min，90～2％b；56～60min，2％ b；洗脱完成后，采用peaks studio 8.5软件分析，并使用ncbi数据库进行blast搜索，筛选出与sea cucumbers蛋白质组匹配的多肽。
25、此外，本专利技术还公开了上述的乌枣参肽在制备营养补充剂或抗氧化剂中的应用。
26、本专利技术具有以下有益效果：
27、本专利技术以乌枣参为原料，获得乌枣参肽的氨基酸序列，制备的乌枣参肽具有良好的体内外抗氧化活性，具有很高的abts自由基的清除能力，为天然抗氧化剂和营养补充剂开发提供了良好的候选化合物。
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1.一种乌枣参肽，其特征在于，选自以下任一种或两种氨基酸序列：WDPR；WGST。
2.如权利要求1所述的乌枣参肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，在酶解前，先将干乌枣参用0.025mol/L柠檬酸水溶液浸泡16～24h，然后取出并置于80～95℃的纯净水中加热60～120min，之后再将乌枣参切块或绞成肉糜；
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体为：将乌枣参酶解物粉末配制成10mg/mL溶液，过0.45μm滤膜；利用Sephadex G-15凝胶柱分离，上样量为3mL，设置流速为0.5mL/min，每4min收集1管，以超纯水进行洗脱，用紫外分光光度计于214nm波长处检测吸光值；收集洗脱液各组分并冻干组分。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S3中，抗氧化活性测试包括体外抗氧化活性测试和以线虫为模型的体内抗氧化活性测试。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S4中，RP-HPLC分离纯化具体为：将步骤S3筛选出
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5具体为：将步骤S4筛选出的组分的水溶液进行离心，获得的上清液通过LC-MS/MS的正离子扫描模式进行分析；流动相由A组分和B组分组成，A组分为含0.1％质量浓度的甲酸的超纯水，B组分为含0.1％质量浓度的甲酸的乙腈，进样体积为10μL，流速为0.25mL/min；梯度洗脱程序如下：0～2min，2％B；2～40min，2～28％B；40～50min，28～40％B；50～52min，40～90％B；52～56min，90～2％B；56～60min，2％B；洗脱完成后，采用PEAKS Studio 8.5软件分析，并使用NCBI数据库进行BLAST搜索，筛选出与Sea cucumbers蛋白质组匹配的多肽。
8.如权利要求1所述的乌枣参肽在制备营养补充剂中的应用。
9.如权利要求1所述的乌枣参肽在制备抗氧化剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种乌枣参肽，其特征在于，选自以下任一种或两种氨基酸序列：wdpr；wgst。
2.如权利要求1所述的乌枣参肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤s1中，在酶解前，先将干乌枣参用0.025mol/l柠檬酸水溶液浸泡16～24h，然后取出并置于80～95℃的纯净水中加热60～120min，之后再将乌枣参切块或绞成肉糜；
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤s2具体为：将乌枣参酶解物粉末配制成10mg/ml溶液，过0.45μm滤膜；利用sephadex g-15凝胶柱分离，上样量为3ml，设置流速为0.5ml/min，每4min收集1管，以超纯水进行洗脱，用紫外分光光度计于214nm波长处检测吸光值；收集洗脱液各组分并冻干组分。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤s3中，抗氧化活性测试包括体外抗氧化活性测试和以线虫为模型的体内抗氧化活性测试。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤s4中，rp-hplc分离纯化具体为：将步骤s3筛选出的组分用超纯水溶解并配制成5mg/ml溶液，经0.22μm膜过滤后，利用配备有unisil c18-bp色谱柱的制备...
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