【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是涉及一种用于hla基因多重扩增的引物组合物、应用和基因分型方法。
技术介绍
1、如下陈述仅提供与本专利技术有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
2、目前，对于hla基因分型检测技术主要有以下几种。
3、（1）pcr-sso（pcr sequence specific oligonucleotide probe，pcr-sso）。该方法利用核酸互补杂交技术结合luminex检测技术来检测hla等位基因，可在96孔微板上检测，实现了所有探针的杂交于液相条件下在同一个孔内进行，而且采用微球磁珠作为载体，具有高通量、快速、简便、可靠的优点，是目前实验室中最常见的方法之一，但主要用于hla中低分辨分型检测。
4、（2）核苷酸序列测定法（pcr sequence based-typing，pcr-sbt）。pcr-sbt方法即第一代测序方法，该方法是直接检测基因的核苷酸序列，是hla高分辨分型的经典方法，结果准确性最高，但是耗时较长，步骤烦多，价格较贵，而且直接双链测序过程中存在模棱两可基因型结果，需要使用其他技术如单链扩增或组特异性测序引物等方法进一步分型检测。
5、（3）新一代测序技术（next generation sequencing technology，ngs）。ngs技术，目前市场上有illumina、ion torrent和华大智造mgi三种主要技术平台，具有超高速、高通量、低成本和高效益等优点，基于ngs技术可同时检测同一基因座位两个不同等位基因
6、近些年分子生物学不断发展，基因测序进入第三代测序-单分子测序时代。第三代测序基本分为以pacbio为代表的光学长度长测序及以nanopore为代表的电信号长度长测序。liu等报道使用hla ngs lr长片段扩增试剂盒制备文库，利用纳米孔技术检测hla基因，发现与ngs测序相比，hla等位基因第一、第二和第三域的一致率为100%、99.5%和99.3%（pcr-sbt精确到第二域）。但是liu等研究中，只对hla-a、-b、-c、-dqa1和-dpa1位点进行5’utr到3’utr全长扩增，而其余位点缺少1号外显子序列，尤其是重要的hla-drb1位点，仍会产生较多模棱两可结果。由于hla-ii类基因座位5’utr到3’utr全长扩增难度很大，尤其对于hla-drb1和-drb3/4/5位点来说，部分区间相似性大，设计引物难度很大，目前未见hla基因11位点5’utr到3’utr全长扩增的报道。而且，hla-dr基因结构的一个显著特点是每种单体型上的dr基因数量和排列相对位置不同，每个单体型中都含有drb1和dra基因，但drb3、drb4或drb5基因却只会出现其中一种或者都不出现，（见图1），这也增加了检测难度。此外，多数对6个hla基因位点（hla-a、-b、-c、-drb1、-dqb1和-dpb1）全长测序的报道中，hla-drb1、-dqb1和-dpb1位点均采用分段扩增，通常1号外显子单独扩增，这极易造成扩增的两段序列不平衡而影响结果准确性。
7、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供用于hla基因多重扩增的引物组合物，该引物组合物能够实现hla基因hla-a、hla-b、hla-c、hla-drb1、hla-drb3、hla-drb4、hla-drb5、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dpa1和hla-dpb1位点合并至四个反应体系中同时扩增，且除去hla-drb5基因其余均可扩增全长，提高了扩增效率和后续对hla基因分型的准确率。
2、为解决上述技术问题，本专利技术特采用如下技术方案：
3、第一方面，提供了一种用于hla基因多重扩增的引物组合物，所述引物组合物包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和第四引物组；
4、所述第一引物组包括hla-a位点引物对和hla-c位点引物对；
5、所述hla-a位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物hla-af1和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物hla-ar1；
6、所述hla-c位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.5所示的上游引物hla-cf和核苷酸序列如seq id no.6所示的下游引物hla-cr；
7、所述第二引物组包括hla-b位点引物对、hla-drb5位点引物对、hla-dqa1位点引物对和hla-dqb1位点引物对；
8、所述hla-b位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.3所示的上游引物hla-bf1和核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物hla-br1；
9、所述hla-drb5位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.13所示的上游引物hla-drb5f1-2和核苷酸序列如seq id no.14所示的下游引物hla-drb5r1-2；
10、所述hla-dqa1位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.19所示的上游引物hla-dqa1f1和核苷酸序列如seq id no.20所示的下游引物hla-dqa1r1；
11、所述hla-dqb1位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.15所示的上游引物hla-dqb1f-2和核苷酸序列如seq id no.16所示的下游引物hla-dqb1r-2；
12、所述第三引物组包括hla-drb1位点引物对和hla-drb3位点引物对；
13、所述hla-drb1位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.7所示的上游引物hla-drb1f-2和核苷酸序列如seq id no.8所示的下游引物hla-drb1r-2；
14、所述hla-drb3位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.9所示的上游引物hla-drb3f和核苷酸序列如seq id no.10所示的下游引物hla-drb3r；
15、所述第四引物组包括hla-drb4位点引物对、hla-dpa1位点引物对和hla-dpb1位点引物对；
16、所述hla-drb4位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.11所示的上游引物hla-drb4f-2和核苷酸序列如seq id no.12所示的下游引物hla-drb4r-2；
17、所述hla-dpa1位点引物对包括核苷酸序列如seq id no.21所示的上游引物hla-dpa1f2和核苷酸序列如seq id no.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于HLA基因多重扩增的引物组合物，其特征在于，包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和第四引物组；
2. 根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，HLA-DRB1F-2、HLA-DRB1R-2、HLA-DRB4F-2、HLA-DRB4R-2、HLA-DRB5F1-2、HLA-DRB5R1-2、HLA-DQB1F-2和HLA-DQB1R-2中的至少一个引物的5’段还连接有修饰序列，所述修饰序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述第一引物组中，所述HLA-A位点引物对和所述HLA-C位点引物对的摩尔比为（0.9~1.1）:（0.9~1.1）；
4.权利要求1~3任一项所述的引物组合物在如下（Ⅰ）~（Ⅴ）任意一项中的应用：
5.用于HLA基因扩增的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~3任一项所述的引物组合物。
6. HLA基因扩增方法，其特征在于，使用权利要求1~3任一项所述的引物组合物扩增待测样本，包括分别使用所述第一引物组、所述第二引物组、所述第三
7. HLA基因测序文库构建方法，其特征在于，包括使用权利要求6所述的HLA基因扩增方法扩增待测样本中的HLA基因，将所述第一引物组的扩增产物、所述第二引物组的扩增产物、所述第三引物组的扩增产物和所述第四引物组的扩增产物混合，构建测序文库。
8.根据权利要求7所述的HLA基因测序文库构建方法，其特征在于，所述第一引物组的扩增产物、将所述第二引物组的扩增产物、将所述第三引物组的扩增产物和将所述第四引物组的扩增产物按照摩尔比（2~2.5）:（10~11）:（7~8）:（4~5）的比例混合。
9.非诊断和治疗目的的HLA基因分型方法，其特征在于，包括使用权利要求1~3任一项所述的引物组合物扩增待测样本中的HLA基因，将扩增产物构建为测序文库，然后测序并对测序数据进行生物信息学分析，获得待测样本中包括11个HLA基因座位的等位基因信息；
10.根据权利要求9所述的HLA基因分型方法，其特征在于，包括使用权利要求7所述的文库构建方法构建测序文库。
...【技术特征摘要】
1.用于hla基因多重扩增的引物组合物，其特征在于，包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和第四引物组；
2. 根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，hla-drb1f-2、hla-drb1r-2、hla-drb4f-2、hla-drb4r-2、hla-drb5f1-2、hla-drb5r1-2、hla-dqb1f-2和hla-dqb1r-2中的至少一个引物的5’段还连接有修饰序列，所述修饰序列的核苷酸序列如seq id no.23所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述第一引物组中，所述hla-a位点引物对和所述hla-c位点引物对的摩尔比为（0.9~1.1）:（0.9~1.1）；
4.权利要求1~3任一项所述的引物组合物在如下（ⅰ）~（ⅴ）任意一项中的应用：
5.用于hla基因扩增的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~3任一项所述的引物组合物。
6. hla基因扩增方法，其特征在于，使用权利要求1~3任一项所述的引物组合物扩增待测样本，包括分别使用所述第一引物组、所述第...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。