【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及mrna疫苗，具体涉及一种仿生工程介导的免疫细胞主动靶向的融合生物质膜的生物体内自运行的树突状细胞膜杂化脂质纳米rna疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、mrna疗法作为一种新兴的治疗方法，已经在新冠疫苗开发中取得了巨大成功，并且在其他领域如心力衰竭治疗、罕见遗传病治疗等方面也展现出了巨大的潜力。这种疗法利用细胞的自然机制来改进传统疫苗和蛋白替代疗法，代表了一种激动人心的新兴技术。然而，尽管mrna疗法具有许多优势，如安全、可编程、灵活和具有成本效益的设计和生产，但在其发展过程中仍然面临着一系列挑战。
2、脂质纳米颗粒(lnps)是将核酸输送到细胞的载体之一。而近年来的研究也证明mrna-脂质纳米颗粒(lnps)是一个强大的、多功能的平台，在抗癌和感染疾病治疗方面具有巨大的潜力。但目前含二甲氨基阳离子脂质及其组成的核酸纳米药物制剂的合成制备和应用还没有深入探究。阳离子脂质体在核酸药物递送领域的应用，因其低细胞毒性、高转染率和良好的生物相容性等优点，成为非病毒基因载体中的重要研究对象。
3、细胞作为一种天然产物，具有低免疫原性、天然靶向能力、长循环时间和天然多配体整合等优势，可以作为一种有效的药物递送载体。在众多细胞中，免疫细胞作为一种独特的细胞，具备特殊的性质，已经被应用于疾病机理研究领域。细胞膜作为细胞生理活动的物质基础，整合了部分细胞生理活动所需的生物信息，可以在一定程度上发挥细胞的功能。
4、近年来，研究者们探究膜杂化脂质体时，主要围绕干细胞和癌细胞细胞膜杂化。细胞膜修
技术实现思路
1、根据现有技术的不足，我们提出具有转染效率高，免疫靶向性好的脂质纳米颗粒的制备方法。
2、本专利技术的技术方案包括：(1)利用低渗超声微囊法，获得提纯后的dc细胞细胞囊泡。(2)掺杂可电离阳离子脂质，使其可以和负电荷的mrna形成复合物，进一步提高核酸的递送效率。(3)将纯化的dc细胞膜提取物与其他脂质材料(如助脂质、胆固醇等)混合使用，并通过纳米沉淀和一锅合成技术将抗原rna负载，形成dc细胞膜杂化脂质纳米rna疫苗。
3、本专利技术的优势：1)具有较高的细胞转染效率。2)具有良好的生物相容性。3)具有较高的包封率与药物释放能力。4)增强药物靶向运输的效率,改善药物的生物分布。
4、具体技术方案如下：
5、一种无核dc细胞细胞囊泡的制备方法；其特征是步骤如下：
6、1)对人源或鼠源的dc细胞进行培养，将获取的活性细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤三次，置于在5ml含有10μg/ml cb的无血清dmem培养基中，在37℃利用低频超声刺激细胞1h，获得细胞外泌混悬液。
7、2)取细胞外泌混悬液，加入5ml dmem，转移到15ml无菌离心管中，混合均匀。将5mlfbs添加到混匀液中，在4℃2000rpm下离心10分钟取得上清液。对获得的上清液再次以5000rpm离心15分钟，收集dc细胞细胞膜囊泡沉淀。
8、3)将细胞膜囊泡沉淀通过0.25％edta去离子水溶液洗涤至上清清澈，制备获得无核dc细胞细胞囊泡溶液。
9、一种脂质纳米颗粒的制备方法；其特征是步骤如下：
10、1)分别将每100μg的可电离的阳离子脂质、30μg的辅助脂质二硬脂酰磷酯酰胆碱(dspc)、55μg的胆固醇、15μg的聚乙二醇化脂质溶于20μl二氯甲烷中，超声混匀，制备脂质储备液。脂质储备液应存放在-20℃冰箱内以保证可用性。
11、2)将每2mg的目标rna溶于1000μl的超纯水或pbs缓冲液中，并通过0.22μm亲水滤膜，以获得澄清的rna浓缩储备液。核酸储备液应存放在-20℃冰箱内以保证活性，并避免反复冻融。
12、3)取脂质储备液20μl，加入1ml的rna储备溶液，充分混匀，形成包载rna纳米脂质颗粒。
13、一种dc细胞膜杂化脂质纳米rna疫苗的制备方法；其特征是步骤如下：
14、1)将1ml rna纳米脂质颗粒37℃温育，并使用水浴超声波仪低频超声以获得粒径均匀分布的阳离子np核心溶液。
15、2)将无核dc细胞细胞囊泡溶液与阳离子np核心溶液以2:1比例(v/v)混合，并使用水浴超声波仪以60w的功率超声间歇处理10分钟，获得dc细胞膜杂化脂质纳米rna疫苗。
16、评估本专利技术制备的dc细胞膜杂化脂质纳米rna疫苗的转染效果的方法如下：
17、1)脂质纳米颗粒包载fitc标记的mrna：取一无菌的1.5毫升的离心管，加入50～200微升无血清培养基opti-mem和0.3～3微克的fitc标记的mrna并充分混匀，再加入等体积的膜杂化脂质纳米rna疫苗混匀后静止10～30分钟。
18、2)将膜杂化脂质纳米rna疫苗移至动物细胞：将含有fitc标记的mrna的膜杂化脂质纳米rna疫苗加入至一24孔板或48孔板的293t或hela细胞中，再于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4～8小时后吸取培养液，加入200～500微升的新鲜完全培养液。培养12～48小时后于荧光显微镜观察并计算转染效率。
19、本专利技术的效果是：
20、1)制备的膜杂化脂质纳米rna疫苗，粒径为100～200纳米，载药率为70～80％。
21、2)本专利技术的方法制备的膜杂化脂质纳米rna疫苗，其细胞转染效率为70～80％，细胞存本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种无核DC细胞细胞囊泡溶液的制备方法，可以通过低渗超声法获取并纯化获得DC细胞膜囊泡，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的无核DC细胞细胞囊泡溶液制备方法，其特征在于，步骤(2)中初次离心在4℃1000-2000rpm下离心，可优选为2000rpm下离心。步骤(2)中二次离心在4000-7000rpm下离心，可优选为6000rpm下离心。
3.一种DC细胞膜杂化脂质纳米RNA疫苗，其特征在于，利用如权利要求1至2中任一项所述的无核DC细胞细胞囊泡制备的DC细胞膜杂化脂质递送载体。
4.根据权利要求3所述的膜杂化脂质纳米RNA疫苗，其特征在于，包括阳离子脂质以及抗原RNA。
5.根据权利要求4所述阳离子脂质如通式I所示：
6.制备权利要求3至4中任一项所述的膜杂化脂质纳米RNA疫苗的方法，所述方法包括：
7.一种含有权利要求3至5任意一项所述的DC细胞膜杂化脂质纳米RNA疫苗的转染测定方法，其特征在于，将权利要求6所制DC细胞膜杂化脂质纳米RNA疫苗混合进行体内外哺乳动物静止或增殖细胞带有荧光标记的m
8.如权利要求4至7所述的DC细胞膜杂化脂质纳米RNA疫苗，所述组合物可用于制备药物和核酸检测工具，应用于以下任一种场景：治疗恶性肿瘤、抗感染、免疫治疗等。
...【技术特征摘要】
1.一种无核dc细胞细胞囊泡溶液的制备方法，可以通过低渗超声法获取并纯化获得dc细胞膜囊泡，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的无核dc细胞细胞囊泡溶液制备方法，其特征在于，步骤(2)中初次离心在4℃1000-2000rpm下离心，可优选为2000rpm下离心。步骤(2)中二次离心在4000-7000rpm下离心，可优选为6000rpm下离心。
3.一种dc细胞膜杂化脂质纳米rna疫苗，其特征在于，利用如权利要求1至2中任一项所述的无核dc细胞细胞囊泡制备的dc细胞膜杂化脂质递送载体。
4.根据权利要求3所述的膜杂化脂质纳米rna疫苗，其特征在于，包括阳离子脂质以及抗原rn...
【专利技术属性】
技术研发人员：太万博，周永飞，黄鹤，
申请(专利权)人：北京荷牧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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