【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学分子标记，特别是涉及一种利用est-ssr引物筛选铁皮石斛杂交亲本的方法。
技术介绍
1、铁皮石斛(dendrobium officinale kimura et migo)又名：黑节草、仙斛兰韵、紫萦仙株。属微子目，为兰科石斛属多年生珍稀药用植物。茎直立，圆柱形，长9-35厘米，粗2-4毫米，萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8cm，宽4～5mm，花期3～6月。主要分布于中国安徽、浙江、福建等地，其以新鲜或干燥茎入药，具有增强免疫、抗氧化、降低血糖和抗肿瘤等多重作用，在医、食领域均有巨大的市场价值。性甘、微寒，归胃、肾经，用于治疗益胃生津，滋阴清热。用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软等症。
2、分子标记鉴定是当今流行的比传统形态鉴定方法更科学和灵敏的重要方法之一，是构建高密度分子遗传图谱、分析物种分类与演化、染色体结构、遗传多样性、品种保护与纯度鉴定的有效工具；但是，普通基因组ssr(gssr)引物扩增条带稳定性较弱，不能反映出个体或群体的遗传变异，且引物通用性较弱。est-ssr标记不仅具有基因组ssr标记中技术简单、重复性好、多态性高和共显性遗传等特点，还具有引物开发廉价、通用性较好、条带清楚、容易统计等优点。此外，由于est-ssr是编码基因的一部分，能够直接获得基因表达的相关信息，这有可能直接鉴定决定重要表型性状的等位基因。随着ncbi中est数据库不断地丰富与完善，使用其序列开发ssr标记也已成为一种十分简
3、而且，在铁皮石斛生产上多用杂交获得的果荚，以种子组培获得实生苗进行生产。然而，生产中发现不同种源之间杂交的成功率和种苗的产量差异巨大。
技术实现思路
1、基于现有技术中的不足，本专利技术提供了一种利用est-ssr引物筛选铁皮石斛杂交亲本的方法，能够对不同种源铁皮石斛进行快速、有效的鉴定。本方法采用的是普通引物进行扩增并用琼脂糖凝胶电泳进行检测，与荧光标记引物的毛细管电泳检测方法相比更经济实惠易于操作。
2、且应用一组est-ssr标记对制种的父本和母本进行遗传相似系数判断，应用该技术筛选的杂交亲本可以保证结实率在80％以上，生产的实生苗强壮，单株鲜重在23克以上。
3、本专利技术的具体技术方案如下：
4、本专利技术提供了一种用于鉴定铁皮石斛品种的est-ssr引物，包括8对引物，分别为：tpsh3、tpsh12、tpsh20、tpsh34、tpsh56、tpsh82、tpsh91、tpsh94，序列如下：
5、tpsh3-f：gacatttggcttcaactacac，
6、tpsh3-r：tcctcttactgagcacaaact；
7、tpsh12-f：gcttacgcacaagatacccag，
8、tpsh12-r：gaggcaaaggcttgagactga；
9、tpsh20-f：tcctctggaagtatgtgtcgg，
10、tpsh20-r：cagagatacgagggaagggag；
11、tpsh34-f：accaaggacaaggagaagaag，
12、tpsh34-r：gactgcgtaaacccactcaaa；
13、tpsh56-f：agcaaaacactacccaaccct，
14、tpsh56-r：gtctcgctccatcgtttactt；
15、tpsh82-f：ggaggagaagattgtggtcag，
16、tpsh82-r：agatgcctgacttttgtatgg；
17、tpsh91-f：agacagatactgacgacccgc，
18、tpsh91-r：tctggatttccgctggataac；
19、tpsh94-f：gttctacatctgcggtcatcc，
20、tpsh94-r：ctcctgattcgtctccacttt。
21、本专利技术还提供了所述est-ssr引物在鉴定铁皮石斛品种中的应用。
22、本专利技术还提供了一种用于鉴定铁皮石斛品种的试剂盒，包括所述est-ssr引物。
23、本专利技术还提供了一种利用est-ssr引物鉴定铁皮石斛品种的方法，包括以下步骤：
24、(1)提取待鉴定样品的dna；
25、(2)以步骤(1)所得dna作为模板，使用所述用于鉴定铁皮石斛品种的est-ssr引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
26、(3)将步骤(2)所得扩增产物进行电泳检测，检测扩增产物的带型，与已知铁皮石斛品种的标准带型进行比对，8对引物的带型全部相同的为同一铁皮石斛品种，从而确定待鉴定样品的品种。
27、优选的，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
28、具体的，每对引物单独检测时，pcr扩增的体系为：1μl模板，5μl的2×hiefftm pcrmaster，1μl上游引物f，1μl下游引物r，2μl的ddh2o。
29、每对引物单独检测时，pcr扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共32个循环；72℃延伸10min；4℃保持。
30、本专利技术还提供了一种利用est-ssr引物筛选铁皮石斛杂交亲本的方法，包括以下步骤：
31、(1)提取待鉴定样品的dna；
32、(2)以步骤(1)所得dna作为模板，使用所述用于鉴定铁皮石斛品种的est-ssr引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
33、(3)将步骤(2)所得扩增产物进行电泳检测，检测扩增产物的带型，进行种源之间遗传相似系数计算，选择遗传相似系数在0.75～0.85的两种铁皮石斛作为铁皮石斛杂交亲本。
34、优选的，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
35、具体的，每对引物单独检测时，pcr扩增的体系为：1μl模板，6μl的2×hiefftm pcrmaster，1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴定铁皮石斛品种的EST-SSR引物，其特征在于，包括8对引物，分别为：TPSH3、TPSH12、TPSH20、TPSH34、TPSH56、TPSH82、TPSH91、TPSH94，序列如下：
2.权利要求1所述EST-SSR引物在鉴定铁皮石斛品种中的应用。
3.一种用于鉴定铁皮石斛品种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述EST-SSR引物。
4.一种利用EST-SSR引物鉴定铁皮石斛品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述利用EST-SSR引物鉴定铁皮石斛品种的方法，其特征在于，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
6.根据权利要求5所述利用EST-SSR引物鉴定铁皮石斛品种的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，PCR扩增的体系为：1μL模板，5μL的2×HieffTM PCR Master，1μL上游引物F，1μL下游引物R，2μL的ddH2O。
7.根据权利要求5所述利用EST-SSR引物鉴定铁皮石斛品种的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，PCR扩增的程序
8.一种利用EST-SSR引物筛选铁皮石斛杂交亲本的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述利用EST-SSR引物筛选铁皮石斛杂交亲本的方法，其特征在于，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
10.根据权利要求9所述利用EST-SSR引物筛选铁皮石斛杂交亲本的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，PCR扩增的体系为：1μL模板，5μL的2×HieffTM PCR Master，1μL上游引物F，1μL下游引物R，2μL的ddH2O；
...【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定铁皮石斛品种的est-ssr引物，其特征在于，包括8对引物，分别为：tpsh3、tpsh12、tpsh20、tpsh34、tpsh56、tpsh82、tpsh91、tpsh94，序列如下：
2.权利要求1所述est-ssr引物在鉴定铁皮石斛品种中的应用。
3.一种用于鉴定铁皮石斛品种的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述est-ssr引物。
4.一种利用est-ssr引物鉴定铁皮石斛品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述利用est-ssr引物鉴定铁皮石斛品种的方法，其特征在于，步骤(2)检测时，每对引物单独检测一次。
6.根据权利要求5所述利用est-ssr引物鉴定铁皮石斛品种的方法，其特征在于，每对引物单独检测时，pcr扩增的体系为：1μl模板，5μl的2×hiefftm pcr master，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李振皓，徐靖，孙健，王志安，蔡龙，姚辉，
申请(专利权)人：浙江寿仙谷医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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