【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物生物合成领域，具体而言，涉及一种lumasiran的制备方法。
技术介绍
1、在现有技术中，由基因表达及突变引起的疾病无法被传统的小分子药物治愈，这类疾病只能通过基因表达干预进行治疗。sirna是长度为19-25nt的双链rna寡核苷酸，可特异性结合同靶基因的mrna，通过阻止翻译的进程，从而达到阻碍靶基因的表达效果，即通过介导rna干扰引起基因沉默。sirna药物的研发给基因治疗带来巨大的发展前景，现已被广泛应用于疾病的治疗领域中。sirna作用于mrna，可成药的靶点要显著大于作用位点是蛋白质的传统小分子药物，且可以通过变换序列而作用于新的靶点。对基因表达进行干预。
2、lumasiran是一种基因靶向治疗sirna类双链rna药物，由alnylam公司研发，用于治疗原发性高草酸尿症i型（primary hyperoxaluria i，ph i），于2020年获fda批准上市。lumasiran是第一个被批准用于治疗ph1的药物，3期临床数据显示，lumasiran治疗显著减少了肝脏中草酸的生成，可促进解决ph1的内在病理生理问题。
3、lumasiran的合成方法主要使用化学固相合成法进行制备，在合成方法中使用固相载体，通过亚磷酰胺三酯法循环合成，合成循环结束后，通过氨解将lumasiran链从固相载体切除，再经过纯化获得目标产品。此制备方法中产品合成的收率随着合成链长的增加而降低，在合成的过程产生的杂质如，比目标序列多一个核苷酸的杂质（n+1杂质）或比目标序列少一个核苷酸的杂质（
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种lumasiran的制备方法，以解决现有技术中制备lumasiran纯度较低的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种lumasiran的制备方法，该lumasiran为由互补配对的正义链和反义链组成的双链sirna，该制备方法包括：
3、将正义链底物片段、反义链底物片段和rna连接酶混合，其中，正义链底物片段能够组成正义链，反义链底物片段能够组成反义链；正义链底物片段和反义链底物片段以碱基互补形成的氢键连接，正义链底物片段和反义链底物片段的头尾碱基之间均未互相连接，形成含有缺刻的双链核苷酸结构；利用rna连接酶将所述缺刻两端的碱基以磷酸二酯键连接，形成lumasiran；缺刻两端的碱基分别为不同底物片段的5’端和3’端，5’端为磷酸根，3’端为羟基；利用rna连接酶连接缺刻上下游的5’端的磷酸根和3’端的羟基，形成磷酸二酯键，获得lumasiran；rna连接酶包括rna连接酶家族1和\或rna连接酶家族2的rna连接酶；优选地，rna连接酶家族1的rna连接酶包括：具有seq id no：3和\seq id no：5所示的氨基酸序列的rna连接酶；rna连接酶家族2的rna连接酶选自：seq id no：1、seq id no：2或seq idno：4所示的氨基酸序列的rna连接酶中的一种或多种；或与seq id no：1~seq id no：5中所示的任一rna连接酶具有70%以上同一性，且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶。
4、进一步地，正义链的核苷酸序列为seq id no：23所示的核苷酸序列，反义链的核苷酸序列为seq id no：24所示的核苷酸序列。
5、进一步地，正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；优选地，正义链底物片段的长度为5-14nt，更优选为8-12nt；优选地，反义链底物片段的长度为4-16nt，更优选为7-12nt。
6、进一步地，正义链底物片段和反义链底物片段均包括2条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段；优选地，第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：9所示的核苷酸序列，第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：10所示的核苷酸序列；第一反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：12所示的核苷酸序列，第二反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：11序列所示的核苷酸序列；优选地，第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：13所示的核苷酸序列，第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：14序列所示的核苷酸序列；第一反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：16所示的核苷酸序列，第二反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：15所示的核苷酸序列。
7、进一步地，第一正义链底物片段的3’端与第二正义链底物片段的5’端在rna连接酶的催化下连接，形成正义链；第一反义链底物片段的3’端与第二反义链底物片段的5’端在rna连接酶的催化下连接，形成反义链；优选地，第一正义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二正义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为l96基团；优选地，第一反义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二反义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为羟基。
8、进一步地，正义链底物片段和反义链底物片段均包括2条时，制备方法包括：将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第一反义链底物片段和第二反义链底物片段混合，在rna连接酶的催化作用下，第一正义链底物片段和第二正义链底物片段连接形成正义链，第一反义链底物片段和第二反义链底物片段连接形成反义链，正义链和反义链通过碱基互补配对形成lumasiran；优选地，将正义链底物片段和反义链底物片段退火后与rna连接酶混合，获得lumasiran。
9、进一步地，正义链底物片段和反义链底物片段均包括3条，正义链底物片段包括第一正义链底物片段、第二正义链底物片段和第三正义链底物片段；反义链底物片段包括第一反义链底物片段、第二反义链底物片段和第三反义链底物片段；优选地，第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：17所示的核苷酸序列；第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：18所示的核苷酸序列；第三正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：19所示的核苷酸序列；优选地，第一反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：22所示的核苷酸序列；第二反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：21所示的核苷酸序列；第三反义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：20所示的核苷酸序列；优选地，制备方法包括：将第一正义链底物片段、第二正义链底物片段、第三正义链底物片段、第一反义链底物片段、第二反义链底物片段、第三反义链底物片段和rna连接酶混合；在rna连接酶的催化作用下，第一正义链底物片本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Lumasiran的制备方法，其特征在于，所述Lumasiran为由互补配对的正义链和反义链组成的双链siRNA，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链的核苷酸序列为SEQ IDNO：23所示的核苷酸序列，所述反义链的核苷酸序列为SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括2条，所述正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，所述反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示；
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID N
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的3’端与所述第二正义链底物片段的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述正义链；所述第一反义链底物片段的3’端与所述第二反义链底物片段的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述反义链。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；所述第二正义链底物片段的5’端为磷酸基团，3’端为L96基团；
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括2条时，所述制备方法包括：
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括3条，
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列；
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将所述第一正义链底物片段、所述第二正义链底物片段、所述第三正义链底物片段、所述第一反义链底物片段、所述第二反义链底物片段、所述第三反义链底物片段和所述RNA连接酶混合；
13.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段及所述反义链底物片段浓度各自独立选自0.1-4.5mM；
14.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的反应温度为10-40℃；
...【技术特征摘要】
1.一种lumasiran的制备方法，其特征在于，所述lumasiran为由互补配对的正义链和反义链组成的双链sirna，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链的核苷酸序列为seq idno：23所示的核苷酸序列，所述反义链的核苷酸序列为seq id no：24所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段包括2条或更多条，反义链底物片段包括2条或更多条；
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物片段和所述反义链底物片段均包括2条，所述正义链底物片段包括第一正义链底物片段和第二正义链底物片段，所述反义链底物片段包括第一反义链底物片段和第二反义链底物片段。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：9所示，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：10所示；
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：13所示，所述第二正义链底物片段的核苷酸序列为seq id no：14序列所示；
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物片段的3’端与所述第二正义链底物片段的5’端在所述r...
【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯·盖吉，张娜，焦学成，王磊，冯骏晨，张冉冉，胡守俊，蒋相军，陈仁芳，贾旭，李少贺，王吉忠，严思堂，金星，刘永贤，王思源，傅绪飞，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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