【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及在所关注的蛋白质的表征期间防止样品诱导的二硫键混乱的方法。
技术介绍
1、质谱法(ms)已经成为分析蛋白质的一种越来越重要的技术。在流行的自下而上的基于ms的蛋白质组学中，还原和烷基化是促进肽鉴定的常规步骤。然而，可能会发生副反应，这会影响实验结果。
2、样品制备是自下而上的基于ms的蛋白质组学的关键步骤。使用基于ms的蛋白质组学的关键挑战之一是在样品制备期间防止二硫键混乱。过去已经开发了许多方法来应对这一挑战。已经注意到，温度、ph和游离半胱氨酸的可用性是在样品制备期间必须控制的关键因素，以防止非天然二硫键的形成。人们普遍认为，即使在室温下，ph也会极大地影响二硫键或半胱氨酸反应性，并且在样品制备期间必须小心控制。所报告的方法教导了在微酸性ph下制备样品，指出了在碱性ph下，游离硫醇被去质子化，并且所得的硫醇盐阴离子被氧化或与相邻的二硫键反应(硫醇/二硫键交换)以形成新的非天然二硫键。
3、在低ph蛋白质烷基化之后，可以提高ph以进行蛋白质消化，这增加了额外的步骤，或者可以维持消化条件的低ph。完全在酸性条件下进行的蛋白质消化将二硫键混乱最小化，但与传统碱性ph消化物相比，产生了具有显著差异(例如，非特异性切割)的消化肽曲线。因此，本领域长期以来一直需要一种不需要低ph蛋白质烷基化的用于蛋白质制备的有效方法。
4、已经开发了一种用于表征所关注的蛋白质，同时防止样品制备诱导的二硫键混乱的形成的方法。所述方法包含在样品制备期间使用新型烷基化剂马来酰亚胺以防止天然二硫键破坏。马来酰亚胺的
技术实现思路
1、与nem类似，当烷基化与变性步骤在酸性条件(ph<6)下同时进行时，马来酰亚胺能够防止方案诱导的二硫键混乱。在酸性条件下进行烷基化步骤后，可以安全地提高ph(例如，到7.5)，以便用胰蛋白酶和/或lysc进行有效的酶促消化，而不会引起另外的二硫键混乱(即，游离硫醇是样品制备期间二硫键混乱形成的主要原因)。
2、在酸性烷基化后，在与传统的非还原肽图谱分析消化物类似的ph下进行消化步骤(例如，使用碘乙酰胺进行半胱氨酸烷基化，随后在ph 7.5下进行酶促消化)产生与传统消化物非常类似的肽曲线。
3、本公开提供了一种用于对样品中的所关注的蛋白质进行非还原肽图谱分析的方法，所述方法包括使所述样品与nem类似物接触以形成所关注的烷基化蛋白质；使所述所关注的烷基化蛋白质与至少一种消化酶接触以形成肽消化物；以及使所述肽消化物经受使用液相色谱法-质谱法的分析以获得所述所关注的蛋白质的所述非还原肽图谱分析。
4、一方面，所述nem类似物的疏水性低于nem的疏水性。另一方面，所述nem类似物的保留时间小于nem的保留时间。在又另一方面，所述nem类似物是马来酰亚胺。
5、一方面，用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约1mm至约10mm。另一方面，用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约2mm至约8mm。在又另一方面，用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约4mm。
6、一方面，所述nem类似物与所述样品在50℃下接触30分钟。
7、一方面，所述所关注的蛋白质是抗体。在特定方面，所述所关注的蛋白质是单克隆抗体或双特异性抗体。
8、一方面，所述方法进一步包括使所述样品与至少一种变性剂接触。在特定方面，所述至少一种变性剂是尿素。在另一个特定方面，所述尿素以介于约6m与约10m之间存在，任选地，其中所述尿素以约8m存在。在另一个特定方面，所述变性在约37℃或约50℃下进行。
9、一方面，所述至少一种消化酶是胰蛋白酶。另一方面，所述至少一种消化酶是lys-c。在又另一方面，所述至少一种消化酶是lys-c和胰蛋白酶。
10、一方面，所述消化在介于约7与约8之间的ph下进行。在特定方面，所述消化在介于约7与约7.5之间的ph下进行。另一方面，所述消化在介于约5与约6之间的ph下进行。在特定方面，所述消化在介于约5.3与约7之间的ph下进行。
11、一方面，所述色谱法步骤包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲水性相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
12、一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
13、本公开提供了一种用于表征样品中的所关注的蛋白质的方法，所述方法包括使所述样品与nem类似物接触以形成所关注的烷基化蛋白质；使所述所关注的烷基化蛋白质与至少一种消化酶接触以形成肽消化物；以及使所述肽消化物经受使用液相色谱法-质谱法的分析以获得所述所关注的蛋白质的所述非还原肽图谱分析。
14、一方面，所述nem类似物的疏水性低于nem的疏水性。另一方面，所述nem类似物的保留时间小于nem的保留时间。在又另一方面，所述nem类似物是马来酰亚胺。
15、一方面，用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约1mm至约10mm。另一方面，用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约2mm至约8mm。在又另一方面，用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约4mm。
16、一方面，所述nem类似物与所述样品在50℃下接触30分钟。
17、一方面，所述所关注的蛋白质是抗体。在特定方面，所述所关注的蛋白质是单克隆抗体或双特异性抗体。
18、一方面，所述方法进一步包括使所述样品与至少一种变性剂接触。在特定方面，所述至少一种变性剂是尿素。在另一个特定方面，所述尿素以介于约6m与约10m之间存在，任选地，其中所述尿素以约8m存在。在另一个特定方面，其中所述变性在约3℃或约50℃下进行。
19、一方面，所述至少一种消化酶是胰蛋白酶。另一方面，所述至少一种消化酶是lys-c。在又另一方面，所述至少一种消化酶是lys-c和胰蛋白酶。
20、一方面，所述消化在介于约7与约8之间的ph下进行。在特定方面，所述消化在介于约7与约7.5之间的ph下进行。另一方面，所述消化在介于约5与约6之间的ph下进行。在特定方面，所述消化在介于约5.3与约7之间的ph下进行。
21、一方面，所述色谱法步骤包括反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲水性相互作用色谱法、混合模式色谱法或其组合。
22、一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或基于orbitrap的质谱仪，其中所述质谱仪耦接到所述液相色谱法系统。
23、本公开提供了一种用于表征样品中的所关注的蛋本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于对样品中的所关注的蛋白质进行非还原肽图谱分析的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述NEM类似物的疏水性低于NEM的疏水性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述NEM类似物的保留时间小于NEM的保留时间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述NEM类似物为马来酰亚胺。
5.根据权利要求1所述的方法，其中用于与所述样品接触的NEM类似物的浓度为约1mM至约10mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其中用于与所述样品接触的NEM类似物的浓度为约2mM至约8mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其中用于与所述样品接触的NEM类似物的浓度为约4mM。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述NEM类似物在50℃下与所述样品接触30分钟。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为抗体。
10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述样品与至少一种变性剂接触。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种消化酶为胰
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种消化酶为Lys-C。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种消化酶为Lys-C和胰蛋白酶。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化在介于约7与约8之间的pH下进行。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化在介于约7与约7.5之间的pH下进行。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化在介于约5与约6之间的pH下进行。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化在介于约5.3与约7之间的pH下进行。
18.一种用于表征样品中的所关注的蛋白质的方法，所述方法包括：
19.一种用于表征样品中的所关注的蛋白质的方法，所述方法包括：
20.根据权利要求19所述的方法，其中用于与所述样品接触的马来酰亚胺的浓度为约4mM。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于对样品中的所关注的蛋白质进行非还原肽图谱分析的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述nem类似物的疏水性低于nem的疏水性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述nem类似物的保留时间小于nem的保留时间。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述nem类似物为马来酰亚胺。
5.根据权利要求1所述的方法，其中用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约1mm至约10mm。
6.根据权利要求1所述的方法，其中用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约2mm至约8mm。
7.根据权利要求1所述的方法，其中用于与所述样品接触的nem类似物的浓度为约4mm。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述nem类似物在50℃下与所述样品接触30分钟。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述所关注的蛋白质为抗体。
10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述样品与...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·克雷恩博格，Y·毛，李宁，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：
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