【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种可同时检出至少20种以上常见感染病原体及耐药株的高通量检测方法，具体涉及通过多重pcr扩增、酶切转化和质谱检测实现对多种临床感染病原体(包括病毒、细菌、衣原体、支原体等)及耐药株的快速鉴定、毒力评价、耐药性评估和病原体载量测定。
技术介绍
1、微生物感染已成为威胁人类健康的一大重要因素。大量研究表明，许多疾病的发生均与微生物感染有关。病原微生物可启动疾病的发生，也可加剧疾病的发展(wisplinghoff,h.,bischoff,t.,tallent,s.m.,seifert,h.,wenzel,r.p.and edmond,m.b.(2004)nosocomial bloodstreaminfections in us hospitals:analysis of 24,179cases from a prospective nationwide surveillance study.clinical infectiousdiseases:an official publication of the infectious diseases society ofamerica,39,309-317)。在对感染性疾病进行诊治的过程中，首先需要明确是何种病原微生物感染，从而选择合适的治疗方案。目前临床感染的诊断主要依赖传统的培养法，将微生物经过一定时间培养后，通过大小、形态等特征及生理生化测试来对微生物的种类进行鉴定。该方法存在耗时长、操作繁琐的缺点(wang,y.and salazar,j.k.(2016
2、除了培养法之外，目前临床上常用的鉴定病原微生物的方法还有微生物蛋白质特征指纹图谱法及荧光定量pcr。微生物蛋白质特征指纹图谱法是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)技术，获取病原微生物的蛋白质组特征信号，从而对细菌的种类进行鉴定(alizadeh,m.,yousefi,l.,pakdel,f.,ghotaslou,r.,rezaee,m.a.,khodadadi,e.,oskouei,m.a.,soroush barhaghi,m.h.and kafil,h.s.(2021)maldi-tofmass spectroscopy applications in clinical microbiology.advances inpharmacological and pharmaceutical sciences,2021,9928238；elbehiry,a.,aldubaib,m.,abalkhail,a.,marzouk,e.,albeloushi,a.,moussa,i.,ibrahem,m.,albazie,h.,alqarni,a.,anagreyyah,s.et al.(2022)how maldi-tof massspectrometry technology contributes to microbial infection control inhealthcare settings.vaccines,10.3390/vaccines10111881.)。具体来说，该方法将新鲜菌落放置在maldi靶板上，并将其与基质充分混合，使蛋白与基质共结晶，经激光电离之后，不同质荷比的多肽片段在质谱加速器中分开，排列成对应的多肽图谱。由于不同菌种的蛋白质种类不同，因此将多肽图谱与数据库中已知的谱图进行对比，即可达到菌种鉴定的目的。该方法的鉴定结果准确性易受到多种因素干扰，如样品的复杂程度，谱图质量等等，且实际样品依旧需培养成单菌落以后再进行检测，耗时长。
3、荧光定量pcr技术在微生物检测领域也有着广泛应用(weiss,d.,gawlik,d.,hotzel,h.,engelmann,i.,mueller,e.,slickers,p.,braun,s.d.,monecke,s.andehricht,r.(2018)fast,economic and simultaneous identification of clinicallyrelevant gram-negative species with multiplex real-time pcr.futuremicrobiology,14,23-32；clifford,r.j.,milillo,m.,prestwood,j.,quintero,r.,zurawski,d.v.,kwak,y.i.,waterman,p.e.,lesho,e.p.and mc gann,p.(2012)detectionof bacterial 16s rrna and identification of four clinically importantbacteria by real-time pcr.plos one,7,e48558；ruan,j.,wang,w.,zhang,t.,zheng,t.,zheng,j.,yu,s.,yu,d.and huang,y.(2020)establishment of a duplex real-timeqpcr method for detection of salmonella spp.and serratia fonticola infishmeal.amb express,10,207.)。根据需要检测的微生物，pcr技术基于变性、退火和延伸三个步骤从复杂的dna库中扩增特定的dna片段，当存在目标微生物时，产生对应的荧光信号。相比于传统的细菌培养法，该方法的优点在于快速、灵敏度高，但多重度受到限制，一次只能检测少数微生物，无法满足同时鉴定多种病原微生物的临床需求。
4、此外，二代测序技术也已经在发现与鉴定微生物领域得到了广泛应用。用于微生物鉴定和表征的最常见ngs方法是扩增子测序：扩增靶标通常选择细菌16s核糖体rna基因，因为它在细菌中高度保守且无处不在，并且还包含九个高变区(v1-v9)，这些区域在细菌种和属之间有所不同，据此可以区分不同的微生物(johnson,j.s.,spakowicz,d.j.,hong,b.-y.,petersen,l.m.,demkowicz,p.,chen,l.,leopold,s.r.,hanson,b.m.,agresta,h.o.,gerstein,m.et al.(2019)eva本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多重病原体及耐药株的高通量快速检测方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原体及耐药株包括但不限于：新冠病毒原始毒株、新冠病毒德尔塔变异株、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎克雷伯菌、幽门螺杆菌及不同毒力型和耐药型、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及其他《人间传染的病原微生物目录》中的各种病原体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述特征基因片段是不同病原体的特异性基因片段，或者是病原体具有单碱基差异的耐药基因片段。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子标签选自：末端为氨基、羧基、巯基、炔基或羟基的C3～C12直链烷烃，末端为氨基或羟基的(PEG)n链且n＝1～8，苯环与醛基、羧基、炔基或苄基相连的小分子，羧基或苄基三唑和直链烷烃相连的小分子，生物素、6-羧基荧光素、花氰染料cy5、6-羧基-2',4,7,7'-四氯荧光素、6-羧基-X-罗丹明、六氯-6-羧基
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子标签选自表1中所列的90种小分子：
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)的反应体系中，所加λ核酸外切酶的浓度为100～150U/mL，所述DNA单链探针的浓度为400～800nM，37℃反应时间为10-20分钟，升温至90℃使λ核酸外切酶失活。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)酶切释放出的各种小分子标记核苷酸的质荷比m/z之差≥3。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)采用液相色谱-质谱联用仪对酶切产物进行质谱分析。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)采用电喷雾电离质谱ESI-MS或基质辅助激光解吸电离质谱MALDI-MS进行质谱分析。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)在进行质谱检测时，首先通过选择离子监测模式对待测小分子标记核苷酸靶标一级质谱进行检测，在确定其峰位置后，使用子离子扫描模式获取小分子标记核苷酸的二级质谱碎裂峰，然后从二级质谱中选择信号最强的两种子离子进行多反应监测。
...【技术特征摘要】
1.一种多重病原体及耐药株的高通量快速检测方法，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病原体及耐药株包括但不限于：新冠病毒原始毒株、新冠病毒德尔塔变异株、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、副流感病毒4型、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎克雷伯菌、幽门螺杆菌及不同毒力型和耐药型、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及其他《人间传染的病原微生物目录》中的各种病原体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述特征基因片段是不同病原体的特异性基因片段，或者是病原体具有单碱基差异的耐药基因片段。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子标签选自：末端为氨基、羧基、巯基、炔基或羟基的c3～c12直链烷烃，末端为氨基或羟基的(peg)n链且n＝1～8，苯环与醛基、羧基、炔基或苄基相连的小分子，羧基或苄基三唑和直链烷烃相连的小分子，生物素、6-羧基荧光素、花氰染料cy5、6-羧基-2',4,7,7'-四氯荧光素、6-羧基-x-罗丹明、六氯-6-羧基荧光素、6-羧基四甲基...
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