【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用了同源重组的基因组编辑细胞的制造方法，主要涉及通过同源染色体之间的同源重组，从而杂合突变被置换成正常序列的细胞的制造方法。
技术介绍
1、随着talens、crispr-cas系统等可编程的核酸酶的出现，现在，基因组编辑技术正在呈现迅速的发展。cas蛋白质与指导rna形成复合体，该复合体与具有指导rna的互补序列的基因组上的靶标位点结合，切割dna双链的双方。作为上一代的基因组编辑技术的talens是以dna为靶标的tale蛋白质与切割dna的核酸酶(主要为foki)的融合蛋白质，但与crispr-cas系统同样地，在基因组上的靶标位点产生dna的双链切割。该dna的双链切割在从细胞外导入成为修复模板的供者dna的情况下，通过基因组与供者dna之间的同源重组，可以进行基因敲入。然而，在利用由基因组编辑系统产生的双链切割的情况下，在靶标部位，与由修复模板产生的敲入相比，更容易发生目的外的突变，另外，还有在与靶标序列类似性高的dna序列(脱靶)中也发生基因组突变这样的问题。
2、于是，本专利技术者们通过使用使cas9的2个核酸酶部位中的一个失活了的切口酶型cas9，利用dna的单链切割来诱导同源重组，从而开发了与现有的利用dna的双链切割的方法相比，能够抑制由非同源末端接合造成的目的外的突变的发生的方法。其一是通过使用切口酶，在作为靶标的基因组导入2个位置的切口、在包含修复模板的供者质粒导入1个位置的切口，从而利用随机切口法的基因组编辑法(非专利文献1、专利文献1)。另外，本专利技术者们使该方法进一步发
3、进而，本专利技术者们作为利用了切口酶的由同源重组产生的基因组编辑法的应用，开发了代替外来的供者dna，利用细胞中本来存在的同源染色体作为修复模板的方法(专利文献2)。根据该方法，能够避免作为修复模板使用的供者dna向基因组中随机整合这样的问题，因此特别在医疗应用中能够提高其安全性。
4、现有技术文献
5、专利文献
6、专利文献1：日本特开2018-11525号
7、专利文献2：国际公开2020/100361号
8、非专利文献
9、非专利文献1：nakajima k,et al.,genome res.28,223-230,2018
技术实现思路
1、专利技术要解决的课题
2、本专利技术的目的在于在利用同源染色体之间的重组的基因组编辑法中，进一步提高基因组编辑的效率和特异性。
3、用于解决课题的手段
4、在细胞内的染色体中存在杂合子突变或者复合杂合子突变的情况下，存在于同源染色体的一方(将其称为“等位基因a”)的基因突变，在同源染色体的另一方(将其称为“等位基因b”)中不存在。这里，假设在等位基因a与等位基因b之间能够诱导同源重组，则在以等位基因b作为供者、以等位基因a作为受者的情况下，能够将等位基因a的突变修复为正常序列；相反，在以等位基因a作为供者、以等位基因b作为受者的情况下，能够在等位基因b的正常序列中导入突变。
5、在专利文献2所记载的方法中，具有如下特征：通过使成为受者的染色体上的作为编辑对象的核苷酸的附近dna区域的多个位置产生切口，并且对于成为供者的染色体，使与受者的染色体上产生切口的位置对应的位置的至少1个位置产生切口，从而特异性地诱导靶标部位的同源染色体之间的重组。
6、本专利技术者们为了进一步提高专利文献2所记载的方法中的基因组编辑的效率和特异性而进行了深入研究，结果发现，通过在进行基因组编辑的细胞中抑制lig4基因、parp1基因、xrcc1基因、msh2基因、或smarcal1基因的功能，从而能够显著提高基因组编辑的效率。进而，本专利技术者们发现，通过采用在等位基因a的突变位点的附近dna区域的1个位置产生切口、并且在等位基因b中在与等位基因a中产生切口的位置不同的1个位置产生切口这样的与专利文献2不同切口方式，从而能够显著抑制目的外的长链dna缺失的发生，提高基因组编辑的特异性，从而完成了本专利技术。
7、因此，本专利技术包含以下的方式。
8、(1)经基因组编辑的细胞的制造方法，
9、该方法包括对同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近dna区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，诱导以该同源染色体的一方为受者、另一方为供者的同源重组，将该特定位点的受者的碱基置换成供者的碱基，
10、该细胞是选自lig4基因、parp1基因、xrcc1基因、msh2基因、和smarcal1基因中的基因的功能被抑制了的细胞，
11、该位点特异性切口酶的组合对于该受者的染色体，在该特定位点的附近dna区域的多个位置进行单链切割，对于该供者的染色体，在与受者的染色体中被单链切割的位置对应的1个位置进行单链切割。
12、(2)根据(1)所述的方法，被置换的受者的碱基是突变碱基，供者的碱基是正常碱基。
13、(3)根据(1)或(2)所述的方法，位点特异性切口酶是crispr-cas系统。
14、(4)用于在(1)～(3)的任一项所述的方法中使用的试剂盒，
15、该试剂盒包含对于同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞而言，在该特定位点的附近dna区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，
16、该细胞是选自lig4基因、parp1基因、xrcc1基因、msh2基因、和smarcal1基因中的基因的功能被抑制了的细胞，
17、该位点特异性切口酶的组合对于该受者的染色体，在该特定位点的附近dna区域的多个位置进行单链切割，对于该供者的染色体，在与受者的染色体中被单链切割的位置对应的1个位置进行单链切割。
18、(5)经基因组编辑的细胞的制造方法，
19、该方法包括对同源染色体的特定位点具有在同源染色体之间不同的碱基的细胞，导入在该特定位点的附近dna区域进行单链切割的位点特异性切口酶的组合，诱导以该同源染色体的一方作为受者、另一方作为供者的同源重组，将该特定位点中的受者的碱基置换成供者的碱基，
20、该位点特异性切口酶的组合对于该受者的染色体，在该特定位点的附近dna区域的1个位置进行单链切割，对于该供者的染色体，在与受者的染色体中被单链切割的位置的对应位置不同的1个位置进行单链切割。
21、(6)根据(5)所述的方法，被置换的受者的碱基是突变碱基，供者的碱基是正常碱基。
22、(7)根据(5)或(6)所述的方法，位点特异性切口酶是crispr-cas系统。
23、(8)用于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.经基因组编辑的细胞的制造方法，
2.根据权利要求1所述的方法，被置换的受者的碱基是突变碱基，供者的碱基是正常碱基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，位点特异性切口酶是CRISPR-Cas系统。
4.用于在权利要求1～3的任一项所述的方法中使用的试剂盒，
5.经基因组编辑的细胞的制造方法，
6.根据权利要求5所述的方法，被置换的受者的碱基是突变碱基，供者的碱基是正常碱基。
7.根据权利要求5或6所述的方法，位点特异性切口酶是CRISPR-Cas系统。
8.用于在权利要求5～7的任一项所述的方法中使用的试剂盒，
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.经基因组编辑的细胞的制造方法，
2.根据权利要求1所述的方法，被置换的受者的碱基是突变碱基，供者的碱基是正常碱基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，位点特异性切口酶是crispr-cas系统。
4.用于在权利要求1～3的任一项所述的方法中使用的试剂盒，
...【专利技术属性】
技术研发人员：中田慎一郎，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：
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