【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于获得胰高血糖素样肽-2(glucagon-like-peptide-2，glp-2)类似物的方法。
技术介绍
1、人glp-2是具有以下序列的33个氨基酸的肽：
2、hy-his-ala-asp-gly-ser-phe-ser-asp-glu-met-asn-thr-ile-leu-asp-asn-leu-ala-ala-arg-asp-phe-ile-asn-trp-leu-ile-gin-thr-lys-ile-thr-asp-oh(seq idno：10)，其中hy是氢。其来源于肠的肠内分泌l细胞和脑干的特定区域中的胰高血糖素原的特异性翻译后加工。glp-2与属于ii类胰高血糖素促胰液素家族的单g蛋白偶联受体结合。
3、据报道，glp-2通过刺激隐窝中的干细胞增殖和通过抑制绒毛中的凋亡来诱导小肠黏膜上皮的显著生长(drucker et al.，1996，proc.natl.acad.sci.usa 93：7911-7916)。glp-2对结肠也具有生长作用。此外，glp-2抑制胃排空和胃酸分泌(wojdemann etal.，1999，j.clin.endocrinol.metab.84：2513-2517)，增强肠屏障功能(benjamin etal.，2000，gut 47：112-119)，通过上调葡萄糖转运蛋白来刺激肠己糖转运(cheeseman，1997，am.j.physiol.r1965-71)，以及提高肠血流量(guan et al.，2003，gastroente
4、在本领域中已经认识到，胰高血糖素样肽-2受体类似物具有用于治疗肠病的治疗潜力。然而，天然的hglp-2，33个氨基酸的胃肠肽，由于其在人中的半衰期非常短(全长glp-2[1-33]为约7分钟，截短的glp-2[3-33]为27分钟)，因此其不可用于临床环境。在很大程度上，短的半衰期是由于通过酶二肽基肽酶iv(dipeptidylpeptidase iv，dpp-iv)的降解引起。因此，在本领域中已经尝试开发具有更好的药代动力学特征的glp-2受体激动剂，特别是以改善glp-2分子的半衰期。举例来说，已经提出了具有替换的glp-2类似物，例如如，在位置2处包含gly替换的glp-2类似物([hgly2]glp-2，替度鲁肽(teduglutide))，其将半衰期从七分钟(天然glp-2)提高至约两小时。还证实了用脂肪酸链使肽药物酰化对于延长全身循环以及提高酶稳定性而不破坏生物效力是有益的。然而，尽管这些尝试已经改善了glp-2类似物的药代动力学，并且其有时在本领域中被描述为“长效(long acting)”，但必须记住，这是与具有约数小时而不是数分钟半衰期的天然hglp-2相比而言的。这继而意味着仍需要向患者每天一次或更多次施用glp-2类似物。
5、wo 2006/117565描述了glp-2类似物，其与[hgly2]glp-2相比包含一个或更多个替换，并且其提高了体内生物活性和/或提高了化学稳定性，例如如在体外稳定性测定中所评估的。特别地，描述了glp-2类似物，其在野生型glp-2序列的位置8、16、24和/或28中的一处或更多处具有替换，任选地与在位置3、5、7、10和11中的一处或更多处以及位置2处的另外的替换和/或氨基酸31至33中的一个或更多个的缺失组合。这些替换也可与稳定肽序列的n端或c端的添加组合。
6、在wo 2006/117565中公开的分子中有zp1848(也称为格列帕鲁肽(glepaglutide))，其被设计成具有改善的化学稳定性和/或生物活性。wo 2018/229252中描述了glp-2类似物包括zp1848及其代谢物(即格列帕鲁肽)的给药方案。
技术实现思路
1、大体上，本专利技术涉及用于合成和纯化胰高血糖素样肽-2(glp-2)类似物(例如zp1848)的改进方法。
2、因此，本专利技术涉及用于产生通过固相肽合成(solid phase peptide synthesis，spps)合成的胰高血糖素样肽2(glp-2)类似物或者其可药用盐或衍生物的方法，其中glp-2类似物由下式表示：
3、r1-his-gly-glu-gly-x5-phe-ser-ser-glu-leu-x11-thr-ile-leu-asp-ala-leu-ala-ala-arg-asp-phe-ile-ala-trp-leu-ile-ala-thr-lys-ile-thr-asp-z2-r2(seqid no：11)
4、其中：
5、r1是氢、c1-4烷基(例如甲基)、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基或三氟乙酰基；
6、x5是ser或thr；
7、x11是ala或ser；
8、r2是nh2或oh；并且
9、z2不存在或者是1至6个lys氨基酸单元的肽序列。
10、在第一方面中，本专利技术提供了产生通过固相肽合成(spps)合成的glp-2类似物的方法，其包括以下步骤：
11、i)用粗glp-2类似物装载柱；
12、ii)用第一缓冲体系调节柱的ph；
13、其中步骤ii)包括当肽在柱上时使经过(passing)肽的等电点。
14、在本上下文中，并且如图1中所示，调节柱上ph的步骤称为“pre-rpc1”。在此pre-rpc1期间，发生了o→n酰基转移。应理解，当肽在柱上时酰基转移发生。换言之，步骤ii)包括当肽在柱上时使经过肽的等电点以进行o→n酰基转移。
15、详细地，在公开方法中glp-2类似物的肽切割期间，发生了o→n酰基转移。这样的酰基转移在本领域是公认的，并且已知在随后的纯化步骤之前将溶液中肽的ph调节至中性和回到酸性条件降低了这些杂质，实际上进行了o→n酰基转移。
16、在本专利技术之前，在溶液中进行该ph调节。然而，对于本专利技术的glp-2类似物，观察到了不期望的沉淀。出乎意料地是，本专利技术人发现该o→n酰基转移可以在柱上进行，避免了材料损失并处理了由沉淀引起的难题。
17、据本专利技术人所知，在柱上经过肽的等电点构成了新的通用方法，并且实际上是在柱上而不是在溶液中进行该“转化”或“纯化”步骤。
18、换言之，本专利技术提供了当glp-2类似物在柱上时，glp-2类似物上进行o→n酰基转移的方法(pre-rpc1)。
19、在该类型的肽合成中使用磷酸盐缓冲剂是期望的，因为已知其有效去除不期望的寡聚物和c端脱酰胺产物。然而，已知所要求保护的结构的glp-2类似物在磷酸盐缓冲剂中沉淀出来，使得磷酸盐缓冲剂的使用对于o→n酰基转移产生问题。因此，甚至更出乎意料的是，本专利技术人能够使用磷酸盐缓冲剂避免材料损失。使用ph调节步骤在柱上进行酰基转移通过节省操作步骤(溶液中单独的ph调节)而提供了另一个优点。
20、适本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.产生通过固相肽合成(SPPS)合成的GLP-2类似物或者其可药用盐或衍生物的方法，其中所述GLP-2类似物由下式表示：
2.权利要求1所述的方法，其中所述第一缓冲体系是磷酸盐缓冲体系。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中Z2是1至6个Lys氨基酸单元的肽序列。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中提高所述柱的酸性pH包括将所述pH提高至中性pH(pH7)。
5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中提高所述柱的酸性pH包括将所述pH提高至pH≥7.2，例如pH为约7.5。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中Z2中Lys单元中的至少一者在所述合成期间用三苯甲基保护基保护。
8.权利要求7所述的方法，其中Z2是2至6个Lys氨基酸单元的肽序列，并且所述方法包括以下步骤：
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中X5是Thr和/或X11是Ala。
10.权利要求9所述的方法，其中所述GLP-2类似物选
11.权利要求9所述的方法，其中所述GLP-2类似物选自：
12.权利要求9所述的方法，其中所述GLP-2类似物是：
13.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中X5是Ser和/或X11是Ser。
14.权利要求13所述的方法，其中所述GLP-2类似物选自：
15.权利要求13所述的方法，其中所述GLP-2类似物是：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.产生通过固相肽合成(spps)合成的glp-2类似物或者其可药用盐或衍生物的方法，其中所述glp-2类似物由下式表示：
2.权利要求1所述的方法，其中所述第一缓冲体系是磷酸盐缓冲体系。
3.权利要求1或权利要求2所述的方法，其中z2是1至6个lys氨基酸单元的肽序列。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中提高所述柱的酸性ph包括将所述ph提高至中性ph(ph7)。
5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中提高所述柱的酸性ph包括将所述ph提高至ph≥7.2，例如ph为约7.5。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中z2中lys单元中的至少一...
【专利技术属性】
技术研发人员：克拉斯·梅兰德，莱拉·马利克，扬·帕夫拉斯，斯特凡·汉森，
申请(专利权)人：西兰制药公司，
类型：发明
国别省市：
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