【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体方法为利用rna干扰(rna interference,rnai)技术，通过设计并整合小干扰rna(small interfering rna,sirna)至卫星rna(satelliterna,satrna)发夹结构中，以预防植物病毒侵染。
技术介绍
1、rnai是一种在植物体内自然发生的分子机制，主要用于防御外来病毒的侵染。该机制的具体过程包含dcl蛋白(dicer-like,dcl)对病毒基因组的切割，产生双链rna(double-stranded rna,dsrna)，进而引发ago蛋白(ago,argonaute proteins)介导的rna诱导的沉默复合体(rna-induced silencing complex,risc)形成，特异性降解外来病毒rna。植物体内产生的小分子rna，包括微小rna(microrna,mirna)、sirna和dsrna，对病原体防御和胁迫响应至关重要，并已成为功能基因组学和生物技术的重要工具。
2、已有许多报道将rnai应用于防控植物病毒，如病毒诱导的基因沉默(virusinterfering gene silence,vigs)、人工合成mirna和编辑植物体内的抗性基因等等方法。
3、郭依等人以烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,trv)为载体，将烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,tmv)、马铃薯y病毒(potato virusy,pvy)、黄瓜花叶病毒(cucumber mo
4、shuo等人针对黄瓜绿色斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,cgmmv)的基因组，设计mirna和反式作用小干扰rna(trans-acting sirna,tasirna)，将这些mirna在植物体内瞬时表达，筛选出最有效的mirna序列，然后建立表达多顺反子人工mirna的稳定转基因黄瓜植物，赋予其对cgmmv的抗病性。人工合成mirna虽然表达精确，但缺乏自主复制和移动能力，通常需要通过转基因技术实现，存在遗传复杂性和公众接受度问题。
5、le等人通过研究pvy在植物中的复制过程，发现pvy复制依赖于植物中的真核转录起始因子(eukaryotic initiation factor,elf4e)，运用基因编辑技术切割寄主的elf4es，得到将elf4es基因敲除的烟草，由于elf4e是一种隐性抗性基因，这种烟草植株获得对pvy病毒的部分抗性。研究植物的抗性基因防治植物病毒，可以有效截断病毒在植物体内的传播通路，但是目前的研究对植物病毒在植物体内的传播机制还不够深入，难以获得完全免疫病毒的栽培品种。
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是通过改造satrna的特定结构，使它表达sirna，实现对植物病毒侵染的有效预防。
2、即，针对现有技术的不足，本专利技术提供一种新的植物病毒防控手段。通过将设计的sirna序列整合至satrna的发夹结构中，利用cmv伴生的satrna和表达少量2b蛋白的cmv变体fny-cmv-2brds，增强植物对植物病毒的抗性。该方法不仅可以提高sirna的表达稳定性和遗传性，而且避免传统转基因和基因编辑技术的局限性，为植物病毒防控提供了一种稳定、高效、遗传的新策略。
3、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种卫星rna预防病毒侵染植物的方法：预防植物病毒侵染的卫星rna基因沉默系统由一种表达特殊小干扰rna的卫星rna和一种弱毒的辅助病毒fny-cmv-2brds组成；
4、卫星rna主体为satt1-kn，把其第90位至109位序列替换为靶向植物病毒基因组的小干扰rna序列，并使之形成新的长发夹结构，本专利技术以tmv为例。
5、说明：
6、本专利技术中，植物病毒以烟草花叶病毒为例；
7、sat-t1-kn、fny-cmv-2brds参照202311809853.5的专利技术《卫星rna系统表达sirna的构建方法及应用》。
8、作为本专利技术一种卫星rna预防病毒侵染植物的方法进一步改进：
9、通过pssrnait网站https://www.zhaolab.org/pssrnait/home.gy设计靶向tmv复制酶的sirna序列，设计sirna具体步骤如下：
10、1)、输入病毒基因组序列至pssrnait网站(https://www.zhaolab.org/pssrnait/home.gy)的fasta format方框内。
11、2)、运行得出结果，根据网站优选说明筛减序列。
12、3)、下载序列，得到21个碱基的小干扰rna序列。
13、4)、将最终得到的序列向3’端延伸1个碱基，使序列的碱基长度为22个碱基，得到靶向病毒基因组的8个小干扰rna序列。
14、筛选得到的靶向tmv复制酶的sirna序列如下：
15、tmv 1：5’-ataacaacagtgtagtacttga-3’
16、tmv 2：5’-aatagcagctgtatctttgagg-3’
17、tmv 3：5’-ataattaagagtactctctgat-3’
18、tmv 4：5’-attgatgtatggaatctgctgt-3’
19、tmv 5：5’-aaagactctatctcctcgttct-3’
20、tmv 6：5’-aggtgtgccttgacaatgcgac-3’
21、tmv 7：5’-atggaatctgctgtgtgtctcc-3’
22、tmv 8：5’-aagcaggttctcagagaagtgg-3’
23、作为本专利技术一种卫星rna预防病毒侵染植物的方法进一步改进：
24、一种卫星rna预防病毒侵染植物的方法中，关于替换至t1-kn第90位至109位序列的sirna序列需要满足以下几点要求：
25、1)、sirna序列第2位碱基不能进行配对；
26、2)、第2位碱基之后，每5个碱基，需要使1对碱基不形成配对，使satrna形成突起；
27、3)、在sirna序列的最后1个碱基后，加上胞嘧啶，序列的最后3个碱基，不与后添加的3个碱基配对，使这7个碱基形成环状结构；
28、4)、补足sirna序列的另一边结构，使之形成长发夹结构。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种卫星RNA预防病毒侵染植物的方法，其特征在于：预防植物病毒侵染的卫星RNA基因沉默系统由一种表达特殊小干扰RNA的卫星RNA和一种弱毒的辅助病毒Fny-CMV-2brds组成；
2.根据权利要求1所述的卫星RNA预防病毒侵染植物的方法，其特征在于：卫星RNA基因沉默表达系统通过RNA干扰途径降解外来病毒基因组，预防外来植物病毒的侵染。
3.根据权利要求1或2所述的卫星RNA预防病毒侵染植物的方法，其特征在于：卫星RNA预防植物病毒的侵染中设计小干扰RNA的方法通过以下步骤实现：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，筛选得到的靶向烟草花叶病毒复制酶的小干扰RNA序列如下：
5.根据权利要求1～4任一所述的卫星RNA预防病毒侵染植物的方法，其特征在于：表达靶向烟草花叶病毒复制酶小干扰RNA的卫星RNA突变体KN-TMV1～-KN-TMV8的序列如SEQ IDNO：2～9所示。
6.一种用于实验验证如权利要求4所述的不同siRNA预防病毒侵染效果的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述
...【技术特征摘要】
1.一种卫星rna预防病毒侵染植物的方法，其特征在于：预防植物病毒侵染的卫星rna基因沉默系统由一种表达特殊小干扰rna的卫星rna和一种弱毒的辅助病毒fny-cmv-2brds组成；
2.根据权利要求1所述的卫星rna预防病毒侵染植物的方法，其特征在于：卫星rna基因沉默表达系统通过rna干扰途径降解外来病毒基因组，预防外来植物病毒的侵染。
3.根据权利要求1或2所述的卫星rna预防病毒侵染植物的方法，其特征在于：卫星rna预防植物病毒的侵染中设计小干扰rna的方法通过以下步骤实现：<...
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