本发明专利技术是关于甘胺酸Ｎ－甲基转移酵素（ＧＮＭＴ）动物模式及其用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术有关于甘胺酸N-甲基转移酵素(GNMT)基因剔除动物模式及其用途。
技术介绍
甘胺酸N-甲基转移酵素(GNMT)，也被称为4S多环芳香族碳氢化合物(PAH)结合 蛋白，具有多种功能。除了作为一个主要叶酸结合蛋白(Yeo EJ,etal.Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91 :210-214)之外，还经由催化甘胺酸合成肌胺酸，来调节S-腺苷甲硫胺酸 (SAM)与 S-腺苷高半胱胺酸(SAH)的比例(Kerr SJ. J Biol Chem 1972 ；247 =4248-4252)。 根据先前的研究报告，于肝癌细胞中GNMT基因表现量会减少(Liu HH, et al. J Biomed Sci2003 ；10 :87-97)。从遗传流行病学研究结果指出，GNMT对于肝癌来说是一种肿瘤易感 受性基因(Tseng TL, et al. Cancer Res 2003 ；63 :647_654)。除此之外，根据报告显示GNMT 可结合苯并芘以及防止DNA键结物的形成。在小鼠体内，GNMT的表现会受到生长激素影响，在雌性小鼠肝脏细胞中GNMT的 表现量比雄性小鼠的表现量高八倍。已有三位儿童患者(两个男孩，一个女孩)的报告指 出，先天性GNMT缺陷是导因于GNMT的基因发生错义突变(Augoustides-Savvopoulou P， et al. J Inherit Metab Dis2003 ;26 :745_759)。这三位小孩都患有高甲硫胺酸血症，肝脏 肿大以及一些临床上类似慢性肝炎的症状(Augoustides-Savvopoulou P，et al. JInherit Metab Dis 2003 ;26 :745_759)，其中这名女孩患者也呈现发育迟缓以及智力缺陷(IQ = 87)。先前技术曾揭露一种GNMT基因剔除小鼠，其显示出肝功能异常且患有肝醣储积 症(US Application No. 11/832，304)。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于研究忧郁症、精神分裂症和阿兹海默症的动物模式，其中该 动物模式为其基因组已藉由在GNMT基因座进行再重组而被打断的哺乳动物。本专利技术亦提供一种用于生产可表现出忧郁症、精神分裂症和阿兹海默症的病理状 态的动物的方法，其包含藉由在GNMT基因座进行再重组而打断该动物的GNMT基因。本专利技术进一步提供一种筛选用于治疗忧郁症、精神分裂症和阿兹海默症的候选药 物的方法，其包含(a)将潜在候选药物投药给予如申请专利范围第1项所述的动物模式， (b)测量该动物对于该候选药物的反应，(c)将该动物的反应与具有GNMT基因野生型的动 物对该药物的反应相互比较，以及(d)基于所观察到该动物和该野生型GNMT基因动物之间 的不同反应而筛选出该候选药物。附图说明图1显示建构出该目标靶定载体的策略。图2显示出针对GNMT基因座的标靶修改。(A)目标靶定载体被设计用来以新霉 素抗性基因取代GNMT外显子1-4和部分外显子5组成。新霉素正向选择标记两侧加上 两个同源区，接着在目标靶定载体3'端接上胸腺甘激酶负向选择标记。(B)胚胎干细胞 株的南方墨点法分析。BamHI(B)-BamHIDNA片段大小从7.9kb (野生型等位基因)减少至 5.3kb。(C)利用聚合酶链锁反应分析GNMT基因剔除鼠的基因型。正常GNMT等位基因产生 772bp片段，而被破坏而插入新霉素的等位基因产生409bp片段。+/+，野生型；+/_，GNMT杂 合型；-/-GNMT基因剔除鼠(D)显示出利用西方墨点法分析证实GNMT蛋白质，每一条包含 10 P g肝溶解产物。GNMT分子量为32kDa，GAPDH 内部对照组。图3显示出GNMT-/-雄性小鼠在前脉冲抑制反应中呈现出显著的前脉冲抑制缺 乏。数据是以平均值士S.E.M.呈现；*p< 0.01.图4显示出利用TST和FST，GNMT-/_呈现出显著于TST(A)和FST(B)中增加静止 不动的时间。数据是以平均值士S.E.M.呈现；*p< 0.05。图5显示出GNMT基因剔除鼠与野生型老鼠在开放式空间活动力并无显著差异。图6显示出GNMT基因剔除小鼠从旋转平衡杆上对于短期潜伏有运动障碍的下降 趋势。数据是以平均值士S. E. M.呈现；*p < 0. 05.图7利用Q-PCR分析显示在GNMT基因剔除公老鼠大脑皮质中与阿兹海默症关联 的基因包括 APP，BACE1, BACE2, APH-1 a，GSK-3 3，MAPT, SNC a 及 IDE 等 mRNA 表现。数据 是以平均值士 S. E.M呈现；*p <0.05。图8利用用免疫荧光影像显示在神经前驱细胞表现出巢蛋白(A)及GNMT(B)。图9利用RT-PCR分析显示GWT mRNA表现在野生型老鼠的脑情形。(A) GWT mRNA 位于老鼠不同脑区的部分。⑴嗅脑⑵皮层层⑶纹状体⑷中脑(5)小脑(6)脊髓(7) 海马体(8)视丘和下视丘(9)桥脑和延脑(10)脑干。(B)利用免疫组织化学染色法观察野 生型老鼠脑部的GNMT的表现。具体实施例方式在细胞模式中可以发现，GNMT表现于老鼠的神经前驱干细胞；而在老鼠动物模式 中，GNMT基因也可以被观察到于神经前驱干细胞和脑部部分区域，如皮质层、纹状体及黑质 (substantia nigra)等区域表现。除此之外，有类似忧郁症和精神分裂症倾向的行为主要 表现在GNMT基因剔除鼠。这些结果表明在脑部功能以及发展过程中，GNMT可能扮演着重 要的作用。根据实验结果显示，GNMT基因剔除鼠脑部的多巴胺以及多巴胺的代谢物(二羟基 苯基乙酸)显著的减少。另外，与野生型老鼠相比，我们观察到GNMT基因剔除鼠在听觉惊 吓测试(acoustics tartle test)的前脉冲抑制反应方面，呈现出显著的缺乏情形，同时也 观察到GNMT基因剔除鼠在悬吊尾巴实验以及强迫游泳实验中比较容易放弃挣扎，静止不 动的时间显著增加。从RotaRod滚轮实验结果显示，GNMT基因剔除鼠平衡运动能力不如野 生型老鼠。GNMT基因剔除鼠呈现类似忧郁症和精神分裂症的行为。利用微数组分析显示， 在GNMT剔除的小鼠模式中，与阿兹海默症相关的基因显著增加。因此，本专利技术动物模式可 用于研究抑郁症，精神分裂症和阿兹海默症。于本专利技术动物模型，其中该动物包括(但不限定于)哺乳动物、灵长类动物和嚿齿动物。较好的具体实施例为老鼠。本专利技术亦提供一种用于生产可表现出忧郁症、精神分裂症和阿兹海默症的病理状 态的动物的方法，其包含经由在GNMT基因座进行再重组而破坏该动物的GNMT基因。病理 状态的特点是在前脉冲抑制反应中呈现出显著前脉冲抑制缺乏，增加悬吊尾巴实验和强迫 游泳实验静止不动的时间，或阿兹海默症相关基因的表现量提升。在阿兹海默症的相关基 因的表现方面，包括(但不限定于)BACE UBACE 2、APH_1、GSK_3、MAPT及IDE的表现量显 著增加。本专利技术还提供了一种筛选用于预防或治疗忧郁症、精神分裂症和阿兹海默症的候 选药物的方法，包括(a)将潜在候选药物投药给予本专利技术的动物模式，(b)测量该动物对 于该候选药物的反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于研究忧郁症、精神分裂症和阿兹海默症的动物模式，其特征在于：所述动物模式为其基因组已藉由在ＧＮＭＴ基因座进行再重组（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）而被坏的哺乳动物。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈宜民，杨境评，
申请(专利权)人：法玛智财科技顾问股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]
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