【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及雌二醇检测，尤其涉及一种用于检测雌二醇的生物传感器及其应用。
技术介绍
1、目前，已经开发出许多用于雌二醇(e2)分析的检测方法，主要包括荧光法、电化学免疫法、高效液相色谱/串联质谱法(hplc-ms/ms)、表面增强拉曼光谱法(sers)等。
2、然而，这些方法需要庞大的设备和高昂的成本，往往在资源有限的地区是不容易实现的。更重要的是，当目标物浓度极低时，这些方法通常不够灵敏。因此，构建简单、灵敏、便携的e2检测方法对临床诊断、环境控制和食品安全具有重要价值。
3、作为实验室仪器的理想替代品，简单而便携的现场检测(poct)设备已广泛应用于各种分析领域，如基于纸基的侧流免疫分析(lfa)、葡萄糖仪(pgm)和温度计。值得注意的是，将现有的poct设备重新用于其他目标物的检测，能够避免设备设计、优化和制造等耗时的过程。其中，妊娠试纸条(pts)由于其简单、方便和可靠的优点而受到关注。在这个过程中，目标物的存在被转化为促人绒毛膜性腺激素(hcg)的生成，因此可以简单地使用pts进行这些目标物的检测，而且此类设备成本非常低廉。有学者开发了一种将基质金属蛋白酶-1的存在与hcg的生成联系起来的方法，从而利用pts监测目标物的浓度。然而，pts用于目标物检测方面仍然存在重要挑战，因为一个目标物分子的识别仅导致一个hcg分子的生成，从而限制了基于pts方法的灵敏度。
4、基于crispr(clustered regularly interspaced short palindromic r
5、为了进一步提高生物传感器的灵敏度，研究人员在生物设计传感器时通常会借助一些信号放大的方法，例如滚环扩增反应(rca)、杂交链式反应(hcr)、酶辅助循环信号放大、催化发夹自组装(cha)。然而，这种传统的信号放大策略仅包含一个信号放大元件，导致检测限仍然维持在亚纳摩尔水平，无法满足环境样本中痕量e2检测的要求。因此，针对痕量e2分析，开发多元化的信号协同放大元件是至关重要的。其中，酶辅助循环扩增已被证明是一种强大的等温扩增方法，它能特异性识别双链dna中特殊的序列片段并进行切割，从而获得目标dna链，实现信号的有效放大。此外，催化发夹自组装(cha)作为一种基于非酶的dna自组装信号放大方法，其快速的反应速率利于提高灵敏度，并且其高特异性能够降低背景信号。由于这些独特的能力，cha在生物传感器发展中作为信号放大元件被广泛应用。
6、因此，如何提供一种能够高灵敏度、高特异性、操作简单的e2检测方法，以解决现有技术中有关e2的检测方法不简便、灵敏度低、无法实现快速现场化的技术问题，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用于检测雌二醇的生物传感器及其应用。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种用于检测雌二醇的生物传感器，包括：cas12a-crrna复合物、cdna和mbs-ssdna-hcg探针。
4、优选的，所述cas12a-crrna复合物由cas12a和crrna孵育结合得到。
5、优选的，所述mbs-ssdna-hcg探针由所述的ssdna将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。
6、本专利技术还提供了一种试剂盒，包括所述生物传感器和妊娠试纸条。
7、本专利技术还提供了一种基于crispr-cas12a便携式即时检测雌二醇的方法，包括如下步骤：
8、(1)将待测样本与mbs-apt-cdna混合孵育，磁分离得到上清液；
9、(2)将所述上清液、hp1和nb.bbvci酶混合进行酶辅助的循环反应，灭酶后，加入hp2和hp3，孵育进行cha反应，得到cha产物；
10、(3)将所述cha产物、cas12a-crrna复合物、rnase和mbs-ssdna-hcg探针混合孵育，得到反应液；
11、(4)使用妊娠试纸条对所述反应液进行检测。
12、优选的，步骤(1)所述mbs-apt-cdna的制备方法为：将apt与cdna混合反应，退火后，得到apt-cdna双链结构；将apt-cdna双链结构修饰到磁珠上得到mbs-apt-cdna。
13、优选的，步骤(1)所述孵育的时间为50～70min；步骤(2)所述hp1和nb.bbvci酶的体积比为1：4～6；所述nb.bbvci酶的浓度为0.5～1.5u/μl；；步骤(2)所述酶辅助的循环反应的时间为50～70min。
14、优选的，步骤(2)所述上清液和hp1的体积比为8～12:1；步骤(3)所述cha产物、cas12a-crrna复合物、rnase和mbs-ssdna-hcg探针的体积比为8～12：3～5：0.6～1.0：2～4；步骤(3)所述孵育的时间为50～70min。
15、本专利技术还提供了所述的生物传感器或所述试剂盒或所述的检测方法在非诊断治疗目的检测雌二醇中的应用。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
17、本专利技术提供的crispr-cas12a介导的e2检测方法，其原理如图1所示。
18、首先，本专利技术利用ssdna将hcg分子固定在链霉亲和素修饰的磁珠(mbs)表面，制备了mbs-ssdna-hcg探针。5'-生物素标记的apt与cdna互补配对形成双链apt-cdna，并通过链霉亲和素与生物素之间作用固定在mbs上。
19、当e2存在时，apt会特异性地与e2结合，apt-cdna双链打开，cdna从磁珠脱落。磁分离后，收集含有cdna的上清液，加入hp1和nb.bbvci酶，启动酶辅助循环反应。nb.bbvci酶可以特异性地识别酶切位点(5'-gctgagg-3')并进行切割释放cdna。释放的cdna可以与另一个hp1分子结合，形成新的双链并再次触发酶切，形成循环反应。这种酶辅助循环反应将有限数量的目标分子e2转化为大量的tdna，从而实现了初级信号放大。
20、然后，收集含有tdna的溶液，加入hp2和hp3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测雌二醇的生物传感器，其特征在于，包括：Cas12a-crRNA复合物、cDNA和MBs-ssDNA-hCG探针；所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述Cas12a-crRNA复合物由Cas12a和crRNA孵育结合得到。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述MBs-ssDNA-hCG探针由所述的ssDNA将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述生物传感器和妊娠试纸条。
5.一种基于CRISPR-Cas12a便携式即时检测雌二醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述MBs-Apt-cDNA的制备方法为：将Apt与cDNA混合反应，退火后，得到Apt-cDNA双链结构；将Apt-cDNA双
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述孵育的时间为50～70min；步骤(2)所述HP1和Nb.BbvCI酶的体积比为1：4～6；所述Nb.BbvCI酶的浓度为0.5～1.5U/μL；步骤(2)所述酶辅助的循环反应的时间为50～70min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述上清液和HP1的体积比为8～12:1；步骤(3)所述CHA产物、Cas12a-crRNA复合物、RNase和MBs-ssDNA-hCG探针的体积比为8～12：3～5：0.6～1.0：2～4；步骤(3)所述孵育的时间为50～70min。
9.权利要求1～3任一项所述的生物传感器或权利要求4所述试剂盒或权利要求5～8任一项所述的检测方法在非诊断治疗目的检测雌二醇中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测雌二醇的生物传感器，其特征在于，包括：cas12a-crrna复合物、cdna和mbs-ssdna-hcg探针；所述cdna的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述crrna的核苷酸序列如seq id no：6所示；所述ssdna的核苷酸序列如seq id no：7所示。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述cas12a-crrna复合物由cas12a和crrna孵育结合得到。
3.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述mbs-ssdna-hcg探针由所述的ssdna将人绒毛膜促性腺激素结合到链霉亲和素修饰的磁珠表面构成。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述生物传感器和妊娠试纸条。
5.一种基于crispr-cas12a便携式即时检测雌二醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述mbs-apt...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛凌梅，贾丽丛，康凯，王翼鹏，姜萌，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：
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