【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛹虫草种性鉴别方法，具体涉及一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法。
技术介绍
1、蛹虫草又称北虫草、北冬虫夏草，是真菌寄生于鳞翅目等昆虫的虫体上形成的虫菌复合体，是一种具有滋补作用的中药和营养品，蛹虫草是目前虫草属中几个可以利用的种类之一，为保证蛹虫草菌种的种性能够维持下去，采用种性鉴别方法实现对蛹虫草菌种鉴别，保证蛹虫草菌种出现退化时及时剔除，以实现菌种的种性稳定维持。
2、现有的蛹虫草菌种种性的鉴别方法采用显微观察法和菌丝活性氧染色法进行蛹虫草菌种的种性维持鉴别，该种鉴别方式需要采用培养基对菌种培养，使其生成菌丝以便于鉴别使用，但是存在以下缺陷：
3、(1)蛹虫草菌种在进行种性鉴别时，采用土豆、小麦以及琼脂粉作为原料制得培养基，而该种培养基所含有的营养成分以及种类较少，同时蛹虫草菌种退化的一个重要原因就是营养缺乏，从而导致培养基在对正常优良菌株培养用于鉴别时，其菌株容易受到缺乏某些元素，使菌种出现变异退化和生长速度减慢，影响对正常蛹虫草种性鉴别的准确性的问题，为此我们提出一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，以解决上述
技术介绍
中提出的蛹虫草在采用培养基进行菌株菌丝培养时容易出现变异退化，进而影响对正常蛹虫草的中心鉴别准确性的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，包括蛹虫草菌种种性的鉴别方法，步骤如下：
3、步骤一
4、步骤二：将浸泡后的河沙土倒去酸水，用自来水冲洗至中性，并将河沙土置于烘干装置内干燥加工；
5、步骤三：对步骤二烘干后的河沙土进行过滤处理；
6、步骤四：将过滤后的河沙土装入试管内于121℃灭菌1小时后保存，制得沙土管；
7、步骤五：取葡萄糖、琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素b、虾米粉、鱼粉加入到混合装置内进行搅拌加工，制得营养原料；
8、步骤六：取小麦加入到煮锅内，并加热煮汁40分钟；
9、步骤七：将小麦煮汁采用纱布过滤，并将过滤后的液体取出装入到试管内；
10、步骤八：将步骤五制得的营养原料加入到步骤七装有小麦煮汁的试管内，同时加入蒸馏水进行搅拌混匀，将混合后的液体装入试管内并放入低温环境内进行冷却成型，制得营养平板培养基；
11、步骤九：筛选生产中表现较好的成熟蛹虫草子实体，将子实体于超净工作台中悬挂于装有沙土的沙土管内部，使子囊孢子弹射入灭菌沙土，待子囊孢子弹射如沙土后，用火焰熔封管口，放室内干燥处保存；
12、步骤十：取沙土管保存的子囊孢子，按照梯度稀释的方法，将子囊孢子浓度稀释至1*104个/ml，取100ul涂布于步骤八制得的营养平板培养基上，放置于20℃培养；
13、步骤十一：将步骤十获得的菌株菌丝块接种于营养平板培养基上，在距离菌丝块2cm处插入灭菌后的盖玻片，20℃避光培养，待菌丝生长覆盖玻片1/2时，取出进行显微结构观察；
14、步骤十二：采用dcfh-da活性氧检测探针法进行活性氧染色观察，将探针与pbs缓冲液以1：1000的比例稀释，-20℃避光保存备用，将附着菌丝的盖玻片浸没于染色液中室温染色30min，置于荧光显微镜下观察。
15、优选的，所述步骤五和步骤六中成分含量分别是小麦汁为180-220g/l、葡萄糖为18-22g/l、琼脂为18-22g/l、硫酸镁为0.5-1.5g/l、磷酸二氢钾为1-3g/l、维生素b为0.05-0.15g/l、虾米粉为3-7g/l以及鱼粉为3-7g/l。
16、优选的，所述步骤三采用过滤筛装置进行过滤加工，所述过滤筛装置的孔径为40目。
17、优选的，所述步骤七中小麦煮汁采用八层纱布过滤处理。
18、优选的，所述步骤八中装有混合液体的试管内加入蒸馏水使其定容至1l后分装，并将分装后的营养混合液体置于121℃高压灭菌20分钟。
19、优选的，所述步骤十二中的dcfh-da是通用的氧化应激指示剂，染色后绿色荧光强度与活性氧含量成正比，绿色荧光在正常菌株菌丝上呈现点状分布，而在退化菌株菌丝中连续分布，呈现较强的荧光，表明较高的活性氧含量。
20、优选的，所述步骤十一中的显示结果分别为正常菌株菌丝大部分粗细均匀、分枝少、线条流畅，菌丝间隔均匀、排列规律，退化菌株菌丝相互粘连融合、杂乱扭曲、分布不均、菌丝打结、分枝增多，菌丝崩裂溶解、细胞内容物流出。
21、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
22、(1)通过设计的葡萄糖、琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素b、虾米粉、鱼粉以及小麦煮汁制备营养平板培养基，本专利技术的虾米粉以及鱼粉均含有大量的维生素，富含b族维生素，尤以维生素b12、b2含量高，还含有维生素a、d和维生素e等脂溶性维生素，含有矿物质，虾米粉和鱼粉是良好的矿物质来源，其中钙、磷的含量很高，且比例适宜，所有磷都是可利用磷，虾米粉和鱼粉的含硒量很高，可达2mg/kg以上，同时鱼粉和虾米粉中碘、锌、铁、砷以及硒的含量也很高，使用于蛹虫草菌种培养用培养基含有营养成分丰富全面，有效避免培养基中所含营养成分不足，造成正常蛹虫草子囊孢子在培养成菌株菌丝时出现变异退化，对蛹虫草菌种的种性鉴别存在误差，同时鱼粉和虾米粉中含有促生长因子，可刺激蛹虫草子囊孢子和菌株菌丝生长发育速度加快，提高蛹虫草种性鉴别效率。
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1.一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：包括蛹虫草菌种种性的鉴别方法，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤五和步骤六中成分含量分别是小麦汁为180-220g/L、葡萄糖为18-22g/L、琼脂为18-22g/L、硫酸镁为0.5-1.5g/L、磷酸二氢钾为1-3g/L、维生素B为0.05-0.15g/L、虾米粉为3-7g/L以及鱼粉为3-7g/L。
3.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤三采用过滤筛装置进行过滤加工，所述过滤筛装置的孔径为40目。
4.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤七中小麦煮汁采用八层纱布过滤处理。
5.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤八中装有混合液体的试管内加入蒸馏水使其定容至1L后分装，并将分装后的营养混合液体置于121℃高压灭菌20分钟。
6.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤十二中的DCFH-DA
7.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤十一中的显示结果分别为正常菌株菌丝大部分粗细均匀、分枝少、线条流畅，菌丝间隔均匀、排列规律，退化菌株菌丝相互粘连融合、杂乱扭曲、分布不均、菌丝打结、分枝增多，菌丝崩裂溶解、细胞内容物流出。
...【技术特征摘要】
1.一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：包括蛹虫草菌种种性的鉴别方法，步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤五和步骤六中成分含量分别是小麦汁为180-220g/l、葡萄糖为18-22g/l、琼脂为18-22g/l、硫酸镁为0.5-1.5g/l、磷酸二氢钾为1-3g/l、维生素b为0.05-0.15g/l、虾米粉为3-7g/l以及鱼粉为3-7g/l。
3.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤三采用过滤筛装置进行过滤加工，所述过滤筛装置的孔径为40目。
4.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种种性的鉴别方法，其特征在于：所述步骤七中小麦煮汁采用八层纱布过滤处理。
5.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：李艳杰，刘桂峰，
申请(专利权)人：内蒙古嘉致农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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