【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌，属于生物。
技术介绍
1、纤维素酶在各行各业有着广泛的应用，利用纤维素酶可以将纤维素类原料或废弃物降解成细菌可发酵利用的糖类用以生产生物燃料、精细化工产品、药品以及生物能源物质。纤维素酶是一类复杂的酶混合物，主要包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，其中，β-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖产生葡萄糖是整个酶解过程的限速酶。
2、里氏木霉(trichoderma reesei)是研究纤维素酶合成机理的常用菌株，也是安全的纤维素酶生产菌种，成为了重要的纤维素酶工业生产菌株(journal of biotechnology,1994,37(3):193-200)。然而，里氏木霉的β-葡萄糖苷酶(bgl1)分泌量较少，极大程度的限制了酶解速率，同时，目前纤维素酶生产菌株还面临着除bgl外的其他纤维素酶，如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和半纤维素酶产量低的问题。纤维素的水解是复合酶共同作用的结果，因此低复合酶产量限制了纤维素酶的使用效率，同时也增加了使用成本，更重要的是也限制了基因工程菌在原位生产线的使用。
3、里氏木霉纤维素酶属于诱导型酶，以纤维素作为底物时可以促进纤维素酶的产生。纤维素的不可溶性，使得纤维素酶的生产与分离变得复杂，同时纤维素酶的吸附会降低酶的产量和活性，因而，开发可溶性的诱导物或工业废弃物诱导产酶可在很大程度上改善提取和成本的问题。纤维二糖、乳糖、槐糖等都是可溶性纤维素酶诱导物，其中，乳糖是最重要以及具有经济可行性的纤维素酶诱导物，但诱导效果不
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是提供一株在不溶性碳源和可溶性碳源乳清诱导下，均能高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌，以解决现有β-葡萄糖苷酶产量低和可溶性诱导物诱导产纤维素酶产量低，酶种类不均衡等问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一株在不溶性碳源和可溶性碳源诱导下，均能高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌bb8，所述里氏木霉基因工程菌bb8已保藏于中国典型微生物保藏中心(cctcc)，地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctcc m 20231192，保藏日期为2023年7月5日。
4、在一种实施方式中，所述基因工程菌bb8是在里氏木霉rut-c30中两次过表达bgl1-his基因得到的，所述的bgl1-his基因序列如seq id no.1所示。
5、在一种实施方式中，bgl1-his基因在里氏木霉rut-c30基因组中的整合位点包括：1)位置：1556580(下游附近)；正向插入；2)位置：1557343(上游附近)；反向插入；3)位置：43320(上游附近)；反向插入。
6、在一种实施方式中，所述基因工程菌bb8的构建步骤如下：
7、(1)提取里氏木霉c30的rna并进行反转录；
8、(2)以里氏木霉c30的cdna为模版设计bgl1-linker-his基因扩增引物，进行pcr扩增；
9、(3)将步骤(2)中pcr扩增后所得产物采用同源重组的方法插入质粒的xbai酶切位点中，得到重组质粒pbgl-his，之后经过基因测序验证该基因正确整合；
10、(4)将步骤(3)中得到的重组质粒pbgl-his导入里氏木霉c30的孢子中，筛选得到8株稳定遗传的高产纤维素酶的转化子，分别命名为bb1、bb2、bb3、bb4、bb5、bb6、bb7和bb8；
11、(5)对获得的稳定遗传的转化子进行3轮稳定的传代培养以使得pbgl-his在转化子中稳定地过表达，之后对转化子进行纤维素酶活检测；
12、(6)基因工程菌和出发菌株在pda固体培养基中于28度培养7天后，取孢子接种于sdb培养基活化30h，接种到含有不同不同诱导物的tmm培养基中培养7天，测定纤维素酶活和蛋白含量。其中bb8无论是在纤维素还是乳清诱导下产生的纤维素酶最高。
13、(7)按照(6)的方法将bb8接种于tmm+2％葡萄糖的培养基中，仍可以产生纤维素酶，而rut-c30则几乎不产生纤维素酶。
14、在一种实施方式中，步骤(1)中，提取和反转录的过程可以按照omega fungal rnakit说明书及takara反转录试剂盒进行。
15、在一种实施方式中，步骤(2)中，所述的bgl1-linker-his基因扩增引物中，
16、上游引物的核苷酸序列为：acccaatagtcaatctagaatgcgttaccgaacagcagc；
17、下游引物的核苷酸序列为:
18、tcggcatctacttctagattagtggtggtggtggtggtggcgttttttcacgctgccgcccggatgatgatgatgcgctaccgacagagtgctcg。
19、在一种实施方式中，步骤(3)中，所述的质粒为pdht/sk。
20、在一种实施方式中，步骤(4)中，筛选得到稳定遗传的转化子的方法为：将重组质粒pbgl-his导入里氏木霉c30的孢子后，在筛选培养基中培养5天得到转化子，再将转化子进行3轮稳定的传代培养以使得bgl1在转化子中稳定地过表达，即得稳定遗传的转化子。
21、在一种实施方式中，所述筛选培养基的配方为：含有相应筛选标记的pda培养基。
22、本专利技术还提供了一种生产纤维素酶的方法，将所述的里氏木霉基因工程菌bb8接种于培养基中，以可溶性或不可溶性碳源为诱导物进行发酵。
23、在一种实施方式中，将乳清诱导下高产纤维素酶的里氏木霉基因工程菌在pda固体培养基中于25～30℃下培养5～10天后，取孢子接种于sdb培养基活化24～50h后，再接种到以乳清为诱导物的tmm培养基中培养5～10天。
24、在一种实施方式中，发酵过程中还进行补料，如前所述发酵至酶产量下降时(5天后)按照终浓度7％(m/v)的乳清添加量进行补料发酵，补料后继续发酵5天。
25、在一种实施方式中，所述的纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、滤纸酶和半纤维素酶。
26、在本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株里氏木霉基因工程菌(Trichoderma reesei)BB8，其特征在于，所述里氏木霉基因工程菌BB8已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231192。
2.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的里氏木霉基因工程菌BB8接种于培养基中，以可溶性碳源或不可溶性碳源为诱导物进行发酵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵过程中还进行补料，控制发酵液中碳源含量不高于10％m/v。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述不可溶性碳源包括微晶纤维素，所述可溶性碳源包括乳清、乳糖、葡萄糖、纤维二糖和甘油。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、滤纸酶和半纤维素酶。
6.一种水解纤维素的方法，其特征在于，将权利要求1所述的里氏木霉基因工程菌BB8或里氏木霉基因工程菌BB8的发酵上清液、发酵液或菌体裂解物加入至含有纤维素的反应体系中进行反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纤维素水解液包括秸秆水解液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应体系还包括诱导物，所述诱导物包括可溶性诱导物和不可溶性诱导物；所述可溶性诱导物包括乳清、乳糖、葡萄糖、纤维二糖和甘油；所述不可溶性诱导物包括纤维素。
10.权利要求1所述的基因工程菌BB8在降解农业、家畜养殖业、厨余垃圾处理业、制浆造纸行业、纺织服装行业及生物医药行业中降解废弃物的应用。
...【技术特征摘要】
1.一株里氏木霉基因工程菌(trichoderma reesei)bb8，其特征在于，所述里氏木霉基因工程菌bb8已保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20231192。
2.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述的里氏木霉基因工程菌bb8接种于培养基中，以可溶性碳源或不可溶性碳源为诱导物进行发酵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵过程中还进行补料，控制发酵液中碳源含量不高于10％m/v。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述不可溶性碳源包括微晶纤维素，所述可溶性碳源包括乳清、乳糖、葡萄糖、纤维二糖和甘油。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的纤维素酶包括β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、滤纸酶和半纤维素酶...
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