【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及明胶微载体领域，具体涉及一种流线型外形明胶微载体的制备方法。
技术介绍
1、细胞大规模培养在生物技术中占重要地位，并已广泛用于生产各种疫苗、酶、激素、抗体、干扰素和核酸等产品。微载体的成功开发和应用使贴壁依赖型细胞的大规模高产培养成为可能。在微载体培养中，细胞在小球表面以单层形式生长，或在大孔结构的孔中以多层形式生长。微载体通常通过轻轻搅拌悬浮在培养基中。通过在悬浮培养和流化床等系统中使用微载体进行细胞培养，每毫升培养基中的细胞产量可超过一亿个，空间利用率非常高。因此，微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，已经广泛应用于培养各种类型的细胞，如间充质干细胞和vero细胞等。
2、传统的细胞微载体为聚苯乙烯微载体和交联葡聚糖微载体。聚苯乙烯微球与细胞的相容性一般，因此细胞在聚苯乙烯微载体表面的粘附较慢；而且聚苯乙烯微球需要较高的转速才能均匀悬浮在培养介质中，高剪切力使得微球之间的碰撞容易损伤细胞。交联葡聚糖载体对细胞有一定的毒性，对于贴壁细胞而言，其生长速度仍不快，且其不可完全酶解，培养细胞的收获难度较大。
3、明胶是胶原部分水解变性而得到的蛋白质，其化学结构与胶原相似，有利于细胞增殖和黏附，具有良好的生物相容性，降解产物无毒，是理想的生物组织工程材料。采用明胶制备细胞微载体十分合适，与传统微载体相比，明胶基微载体生物相容性更优，且可完全酶解，细胞收获便利，具有更高的产率和可扩展性。为了降低培养基的搅拌速度，减少微球碰撞造成的细胞损伤，具有水滴流线型外形的微载体更具优势
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种多孔明胶微载体的制备方法，用以解决现有技术中的细胞微载体问题。
2、本专利技术提供了一种多孔明胶微载体的制备方法，包括如下步骤：
3、（1）配制1~20%浓度的明胶水溶液，配制的过程中将水溶液升温至45~65℃并持续搅拌；
4、（2）配制油相和乳化剂的混合溶液：将乳化剂按照浓度0.1~5%的比例与油相进行混合，并在搅拌状态下升温至45~65℃；
5、（3）将步骤（1）配制的明胶水溶液缓慢加入到步骤（2）配制的油相和乳化剂的混合溶液中，加入的过程中持续搅拌并维持体系温度为45~65℃，加入完成后继续搅拌5~60min获得w/o型乳液，所述明胶水溶液与油相和乳化剂的混合溶液的质量比为1:2~1:10；
6、（4）将步骤（3）获得的w/o型乳液降温到1~15℃并持续搅拌，使明胶凝胶固化得到明胶乳液；
7、（5）将步骤（4）获得的明胶乳液直接过滤或加入20~200%的有机溶液破乳后过滤，将滤得的明胶微球通过有机溶剂洗涤2~6次，最后过滤收集；
8、（6）将步骤（5）获得的明胶微球在搅拌的状态下慢慢分散到去离子水中，过滤清洗2~6次，最后过滤收集；
9、将过滤收集的明胶微球不经干燥直接分散到去离子水中，可大大加快明胶微球在水中的分散速率，且避免了干燥后分散容易出现微球黏连的情况；
10、明胶微球经有机溶剂洗涤后不交联直接分散到去离子水中过滤，由于明胶微球不交联分散到水中时十分脆弱，一般过滤过程极其容易发生黏连，本专利技术通过优选滤网孔径采用重力过滤的方式实现了明胶微球不经交联在水中直接过滤，过滤过程中也没有发生任何微球黏连的情况；不交联直接过滤避免了微球在过滤前交联对最后的明胶微载体造孔的不利影响；
11、（7）将步骤（6）获得的明胶微球分散到去离子水中，并加入交联剂，在1~15℃的温度下反应0~24h，随后将反应溶液倒入扁平容器或圆柱状容器中；
12、（8）将步骤（7）中装有反应溶液的容器浸没在冷却液中2~600min，冷却液的温度-80~-5℃，使明胶溶液完全结冰后取出，并放置在-25~-5℃环境下继续交联12~48h；
13、将高导热扁平容器或圆柱状容器浸没在低温冷却液中快速建立降温梯度的方法使容器内明胶溶液结冰，制备的明胶多孔微载体表面孔径大小为10~40μm，孔径大小合适，孔径分布均匀，且该微载体具备流线型的形状，十分适合细胞悬浮培养；
14、（9）待步骤（8）交联完成后，将容器放置在常温空气或浸没在10~40℃的水溶液中，化冰后过滤回收微载体，并使用去离子水清洗2~6次；
15、（10）将步骤（9）获得的明胶微载体重新分散到水中，冷冻干燥并经灭菌处理后获得流线型的多孔明胶微载体。
16、进一步的，所述步骤（1）中明胶水溶液的明胶为a型和/或b型。
17、进一步的，所述步骤（2）中的油相为植物油、矿物油、石油醚、烃中的一种或几种的组合，所述烃为己烷、庚烷、环己烷、甲苯或二甲苯。
18、进一步的，所述步骤（2）中的乳化剂为吐温、单硬脂酸甘油酯、司班中的一种或几种的组合。
19、进一步的，所述步骤（5）中的有机溶剂为乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种的组合。
20、进一步的，所述步骤（6）-步骤（7）中去离子水的温度均为1~15℃。
21、进一步的，所述步骤（7）中的交联剂为甲醛、戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺、四甲基乙二胺和京尼平中的一种或几种。
22、进一步的，所述步骤（7）中的容器材质为玻璃、石英、金属、合金中的一种或几种的组合，容器采用高导热率的材质，避免低导热率的材质如塑料、橡胶等造孔效果差或无法造孔的问题，所述扁平容器的横截面为扁平状，具体为矩形、菱形或椭圆形，横截面内腔的长边为l，短边为d，短边的长度≤20mm，所述圆柱状容器的横截面为圆形，且内腔圆的直径≤20mm，避免了短边长度和圆的直径大于20mm导致孔结构差或无法造孔的问题。
23、进一步的，所述滤网的孔径为20~300μm。
24、采用上述本专利技术技术方案的有益效果是：
25、本专利技术以明胶为原料，以乳液法制球，并通过控制热传导方向和速率形成冰晶的方式制备多孔明胶微载体；
26、所制备的明胶微载体呈流线型多孔结构，符合流体力学特性，具有孔径大小合适、孔隙率高的优点，在搅拌状态下更容易稳定悬浮在培养介质中，更加有利于细胞贴壁生长；
27、多孔明胶微载体为非刚性结构，搅拌过程中微载体不会损伤细胞，天然多肽结构对细胞完全无毒，与细胞的相容性好，因此细胞在明胶微载体表面贴附速率快，细胞悬浮培养实验证明该微载体大幅提高了细胞的扩增速度；
28、明胶微载体采用特异性的酶（如胶原酶）可以完全降解，从而更加容易的收获贴壁细胞。
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1.一种流线型外形明胶微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中明胶水溶液的明胶为A型和/或B型。
3.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的油相为植物油、矿物油、石油醚、烃中的一种或几种的组合，所述烃为己烷、庚烷、环己烷、甲苯或二甲苯。
4.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的乳化剂为吐温、单硬脂酸甘油酯、司班中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的有机溶剂为乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）-步骤（7）中去离子水的温度均为1~15℃。
7.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中的交联剂为甲醛、戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺
8.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（7）中的容器材质为玻璃、石英、金属、合金中的一种或几种的组合，所述扁平容器的横截面为扁平状，具体为矩形、菱形或椭圆形，横截面内腔的长边为L，短边为D，短边的长度≤20mm，所述圆柱状容器的横截面内腔为圆形，且圆的直径≤20mm。
9.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述滤网的孔径为20~300μm。
...【技术特征摘要】
1.一种流线型外形明胶微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中明胶水溶液的明胶为a型和/或b型。
3.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的油相为植物油、矿物油、石油醚、烃中的一种或几种的组合，所述烃为己烷、庚烷、环己烷、甲苯或二甲苯。
4.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的乳化剂为吐温、单硬脂酸甘油酯、司班中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的有机溶剂为乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的多孔明胶微载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：甘少磊，马军，
申请(专利权)人：江西博恩锐尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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