ＴＧＦ－β不敏感的前列腺癌特异性的ＤＣ细胞疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种ＴＧＦ－β不敏感的前列腺癌特异性的ＤＣ细胞疫苗的制备方法，其能有效地治疗前列腺癌，真正实现主动免疫和过继性细胞免疫相结合的前列腺癌特异性免疫基因治疗。本发明专利技术采用的技术方案为：１）构建含有显性负相ＴＧＦ－βＩＩ型受体（ＴβＲＩＩＤＮ）质粒的逆转录病毒；２）负载前列腺癌抗原的ＤＣ细胞分离、培养及鉴定；３）ＤＣ细胞转染，获取ＴβＲＩＩＤＮ－ＤＣ细胞；４）ＴβＲＩＩＤＮ－ＤＣ细胞体外实验；５）ＤＣ疫苗体内抗肿瘤评价；６）体内ＣＴＬ活性检测。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种ＴＧＦ－β不敏感的前列腺癌特异性的ＤＣ细胞疫苗的制备方法，其特征在于：　　　　１）构建含有显性负相ＴＧＦ－βⅡ型受体ＴβＲⅡＤＮ质粒的逆转录病毒：含有ＴβＲⅡＤＮ质粒的逆转录病毒转染２９３包装细胞，３２℃下共转染１２小时，１０％ＤＭＥＭ培养基３７℃下孵化过夜，ＰＢＳ漂洗后同样条件再次转染２９３细胞２４小时，收集上清，获得含有ＴβＲⅡＤＮ重组逆转录病毒；　　　　２）负载前列腺癌抗原的ＤＣ细胞分离、培养及鉴定：将Ｃ５７ＢＬ／６小鼠新鲜骨髓用红细胞去除法获取ＤＣ细胞，加入含ｒｈＩＬ－４（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）的完全培养基，隔日半量换液，在第６ｄ梯度离心收获非粘附细胞为非成熟的ＤＣ细胞；反复冻融获得ＴＲＡＭＰ－Ｃ２细胞裂解物，裂解物反复刺激非成熟的ＤＣ细胞获得负载前列腺癌抗原的成熟ＤＣ细胞；于光镜下形态学鉴定，用流式细胞仪检测细胞表型ＭＨＣ　　ｃｌａｓｓ　　Ⅱ，ＣＤ４０，ＣＤ１１ｃ，ＣＤ８０和ＣＤ８６；　　　　３）ＤＣ细胞转染，获取ＴβＲⅡＤＮ－ＤＣ细胞：含有ＴβＲⅡＤＮ重组逆转录病毒转染负载前列腺癌抗原的ＤＣ细胞５％ＣＯ２、３７℃下孵化４８小时，获得表达ＴβＲⅡＤＮ的ＤＣ细胞，流式细胞仪检测ＤＣ细胞表型变化；　　　　４）ＴβＲⅡＤＮ－ＤＣ细胞体外实验：不同的ＤＣ细胞与ＴＧＦ－β共同培养，流式细胞仪测定表面共刺激分子ＣＤ８０／ＣＤ８６变化，脱氧胸腺嘧啶苷核素掺入法进行增殖抑制实验，Ｗｅｓｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔ检测ＳＭＡＤ－２和磷酸化ＳＭＡＤ－２的表达；　　　　５）ＤＣ疫苗体内抗肿瘤评价：建立前列腺癌ＴＲＡＭＰ－Ｃ２细胞皮下荷瘤Ｃ５７ＢＬ／６小鼠模型，皮下荷瘤小鼠４０只，随机分为４组，每组１０只，分别皮下注射ＴβＲⅡＤＮ－ＤＣ细胞、负载前列腺癌抗原的ＤＣ细胞、ＧＦＰ－ＤＣ细胞和磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），１５天后重复注射，酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）测定细胞因子ＩＦＮ－γ和ＩＬ－１２变化，观察各组荷瘤小鼠的生存期和肿瘤的体积改变；６）体内ＣＴＬ活性检测：最后一次疫苗免疫后５ｄ取其脾脏，分离、活化Ｔ淋巴细胞，Ｃｒ５１释放实验测定肿瘤特异性杀伤Ｔ细胞（ＣＴＬ）对ＴＲＡＭＰ－Ｃ２细胞的细胞毒作用；黑色素瘤细胞Ｂ１６－Ｆ１作为对照靶细胞。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王福利，秦卫军，袁建林，田丰，温伟红，宋朝军，董青川，王龙信，郭应禄，王禾，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]