【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于天然酶固定化与生物传感器，具体涉及级联反应的葡萄糖氧化酶(gox)和辣根过氧化物酶(hrp)在蛋白-无机杂化纳米花(decn)中有序固定的新方法，并将其包封在水凝胶中构建便携化的亚硝酸盐可视检测传感器。
技术介绍
1、基于生物酶构建的传感器在医学诊断、环境监测和食药检测等方面有广泛的应用和研究。生物酶的高活性和特异性为开发优质性能的生物传感器提供了保障。但是，由于生物酶的蛋白质本质，其在苛刻条件下(高温、极端ph和有机溶剂等)极易发生空间构象的变化，导致活性丧失，这极大地阻碍了酶基生物传感器的产业化发展。
2、固定化酶技术为生物酶的工业化生产提供可靠技术，通过将酶束缚或限制在固体材料一定区域内，既保留酶原有催化活性，又可提升酶对环境的抵抗性，同时，固定化酶的非均相性使其便于后续的产物分离操作，提高酶的循环使用次数。蛋白无机杂化纳米结构是一种花状的纳米材料，具有较高的比表面积、强大的吸附能力、优异的催化性能和高效的负载能力，是天然酶固定化的良好载体。通过温和的生物矿化自组装方式，使天然酶固定于无机盐形成的骨架中，可以限制蛋白结构构象，提高酶的催化效率和稳定性。但是，在当前的基于蛋白无机杂化纳米结构固定酶的策略中，往往是固定单一酶，或者是多酶杂乱混合固定。混合无序的固定方式不利于级联酶反应时中间产物的流窜，因此会阻碍级联酶各自优势的最佳利用，导致其利用率低。所以必须研究级联酶固定化的最佳方式，以满足中间产物的顺利流窜和高效利用，同时提高酶的整体催化效率和稳定性。
技术实现思路b>
1、本专利技术的目的是提供一种级联酶gox和hrp的有序固定化方法，并构建基于gox@hrpdecn的传感器检测亚硝酸盐。
2、本专利技术通过生物矿化自组装方法，使gox先固定于磷酸铜骨架上形成花状结构goxdecn，待其生长到一定的程度后，引入的hrp与goxdecn通过静电吸附作用搭载在其表面，形成分层的级联酶花状纳米结构gox@hrp decn。由于在gox@hrp decn中级联酶分层有序，为中间产物的运输提供了特定路线，酶的催化效率和利用率进一步提高。decn也对生物大分子起到保护作用，固定在其中的酶较天然酶，在不适宜、极端环境中表现出更好的稳定性。借助gox@hrp edcn优异的催化活性和稳定性，构建[gox@hrp decn+葡萄糖+3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)]反应体系检测亚硝酸盐。进一步将gox@hrp decn封装于具有固定和保护作用的多孔网络结构水凝胶中，在增强其稳定性和便携化的同时，实现智能手机拍照后的图像输出。将水凝胶的多彩图像转化为色坐标数据信息准确定量检测亚硝酸盐，为亚硝酸盐的现场便携化检测提供了技术支撑。
3、本专利技术所述的级联反应酶gox和hrp的有序固定化方法及其用于亚硝酸盐检测的步骤如下：
4、a、gox@hrpdecn的制备：
5、将gox(8mg/ml)、pbs缓冲液(10mmol/l、ph＝7.4)和cuso4·5h2o(0.2mol/l)按照体积比10：87：3，在2.0ml离心管中混合3～5min，随后在4℃条件下静置12～15小时。通过在2000～3000rpm下离心1～3min，除去上清液之后，按照体积比9：1加入pbs缓冲液(10mmol/l、ph＝7.4)和hrp(12mg/ml)复溶，在4℃下静置12～15小时。再在2000～3000rpm下离心1～3min后，除去上清液，并用去离子水洗涤1～2次，以去除多余的蛋白。将得到的gox@hrpdecn复溶于pbs缓冲液(10mmol/l、ph＝7.4)制备浓度为0.04mg/ml的固定化酶材料，4℃储存备用。
6、b、比色传感平台构建及“a652nm/a455nm-亚硝酸钠浓度”的标准关系曲线绘制
7、将干燥至恒重的亚硝酸钠用超纯水溶解配置不同浓度的亚硝酸钠溶液(0.008、0.01、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8mmol/l)。将gox@hrp decn(0.04mg/ml)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(10mmol/l，ph＝4.5)、葡萄糖水溶液(40mmol/l)、tmb溶液(1mmol/l)、超纯水和不同浓度的亚硝酸钠溶液按照比例体积比5：5：5：2：3：5混合均匀，在25℃下孵育20～40min，用紫外分光光度计检测652nm和455nm处的吸光度值，将652nm处的吸光度值(a652nm)和455nm处的吸光度值(a455nm)做比(a652nm/a455nm)，即可获得不同浓度亚硝酸钠对应的a652nm/a455nm数值，从而建立“a652nm/a455nm-亚硝酸钠浓度”的标准关系曲线。
8、c、包封gox@hrp decn的琼脂糖水凝胶的制备：
9、配置10mg/ml的琼脂糖水溶液，80～95℃加热至完全溶解为均匀的液态。将gox@hrp decn(0.04mg/ml)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(10mmol/l，ph＝4.5)和琼脂糖水溶液(10mg/ml)以5：5：13的体积比混匀，放置于室温下形成固态凝胶备用。
10、d、基于水凝胶的传感平台构建及“色坐标(r/g)－亚硝酸盐浓度”的标准关系曲线绘制
11、将干燥至恒重的亚硝酸钠用超纯水溶解配置不同浓度的亚硝酸钠溶液(0.1、0.4、0.8、1、1.4、1.8、2、2.5、3、3.5、4mmol/l)。将包封有gox@hrpdecn和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的琼脂糖水凝胶、葡萄糖水溶液(40mmol/l)、tmb溶液(2mmol/l)和不同浓度的亚硝酸钠溶液按照体积比23：5：2：20混合。在25℃下反应40～70min后，利用自制拍照暗箱，通过智能手机采集图像。使用商业软件image j直接分析图像的色坐标(包括红色通道r、绿色通道g和蓝色通道b)，即可获得不度亚硝酸钠浓度对应的色坐标，通过红色通道的色坐标值/绿色通道的色坐标值(r/g)对数据进行处理，从而建立“r/g-亚硝酸钠浓度”的标准关系曲线。
12、e、实际样品的检测
13、将新鲜的大白菜洗净、晾干、切碎制成匀浆备用。将市售酸菜沥干水分后切碎制成匀浆备用。分别称取5g(精确至0.001g)上述匀浆试样，置于具塞锥形瓶中，将饱和硼砂溶液(50g/l)和70℃左右的水按照体积比1：12混匀，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。将上述混合溶液、亚铁氰化钾溶液(106g/l)、乙酸锌溶液(220g/l)和水按照体积比65：4：11混合摇匀，以沉淀蛋白质。摇匀，放置30min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤，弃去一定体积的初滤液，滤液备用。对于酸菜汁，称取试样90g(精确至0.001g)，置于具塞锥形瓶中，将饱和硼砂溶液(50g/l)和70℃左右的水按照体积比1：12混匀，于沸水浴中加热15min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。将上述混合溶液、亚铁氰化钾溶液(106g/l)、乙酸锌溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种级联酶有序固定方法，其步骤如下：
2.如权利要求1所述的一种级联酶有序固定方法，其特征在于：GOX和HRP分两个步骤加入，步骤(1)中GOX的加入量为0.8mg，步骤(2)中HRP的加入量为1.2mg。
3.一种基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料，其特征在于：是由权利要求1和2所述的方法制备得到。
4.权利要求3所述的一种基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料作为检测试剂在亚硝酸盐液相传感平台中的应用，其特征在于：亚硝酸盐的检测范围为1.6～360μmol/L。
5.权利要求4所述的一种基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料作为检测试剂在亚硝酸盐液相传感平台中的应用，其步骤如下：
6.一种包封基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料的水凝胶反应器的制备方法，其步骤如下：
7.一种包封基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料的水凝胶反应器，其特征在于：是由权利要求6所述的方法制备得到。
8.权利要求7所述的包封基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料的水凝胶反应器在亚硝酸盐可视检测中的应用，其特征在于：亚
9.权利要求8所述的包封基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料的水凝胶反应器在亚硝酸盐可视检测中的应用，其步骤如下：
...【技术特征摘要】
1.一种级联酶有序固定方法，其步骤如下：
2.如权利要求1所述的一种级联酶有序固定方法，其特征在于：gox和hrp分两个步骤加入，步骤(1)中gox的加入量为0.8mg，步骤(2)中hrp的加入量为1.2mg。
3.一种基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料，其特征在于：是由权利要求1和2所述的方法制备得到。
4.权利要求3所述的一种基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料作为检测试剂在亚硝酸盐液相传感平台中的应用，其特征在于：亚硝酸盐的检测范围为1.6～360μmol/l。
5.权利要求4所述的一种基于级联酶有序固定方法合成的纳米材料...
【专利技术属性】
技术研发人员：李红霞，王荷蕊，闫旭，孙春燕，张铁华，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：
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