【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞，尤其涉及一种间充质干细胞生物支架复合物的制备、冻存及复苏方法。
技术介绍
1、烧伤是生活中常见的创伤。在过去几十年中，尽管严重烧伤的治疗取得了重大进展，但为了继续优化目前的烧伤治疗方案，应首先研究如何加速创面愈合、减轻烧伤引起的高代谢分解反应、控制全身感染和缩短功能恢复的总时间，以提高严重烧伤患者的预后。皮肤创伤后引起的各种损害如新陈代谢加剧、体温下降、水分和蛋白质的过度散失及内分泌和免疫系统的失调均与皮肤屏障作用的丧失有关。尽早地覆盖创面可以减少烧伤病死率并能有效改善愈合后和外观。
2、近年来干细胞治疗成为国内外研究的热点，间充质干细胞因其具有自我更新、高度增殖与多向分化的能力，成为组织再生与修复的希望。间充质干细胞极易从骨髓、牙龈、脂肪、脐带、胎盘等组织中被分离出来，并且可以实现高效的体外扩增。它不仅能够在特定的环境中分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、内皮细胞、心肌细胞、神经细胞等，而且还具有免疫调节作用，常用来进行自体移植和同种异体移植。间充质干细胞主要通过旁分泌细胞外囊泡、趋化因子、细胞因子和生长因子等发挥免疫调节、促血管生成、抗细胞凋亡和抗氧化作用，促进创面愈合和组织再生。
3、尽管间充质干细胞在促进烧伤创面愈合中显示出了治疗潜力，但是目前仍然难以应用于临床治疗中，其原因在于：
4、第一，目前的间充质干细胞临床治疗效果不佳。
5、虽然目前的临床研究结果显示在深度烧伤患者创面涂布间充质干细胞悬液，能够促进皮肤再生和血管新生，但单纯的细胞悬液很难
6、第二，目前的间充质干细胞难以实现较好的远距离运输。
7、干细胞治疗流程涉及细胞采集、细胞培养、细胞移植治疗等过程。通常，这些过程的实施地点或者时间并不一致，用于治疗的细胞会在不同的地点之间运输。在常温或37℃环境中，细胞增殖迅速、代谢旺盛、耗氧高、能耗大，产生的大量氧自由基和脂质过氧化物，必须及时通过更换培养基清除，否则引起环境ph和渗透压变化，造成细胞死亡。若仅仅增加培养基，细胞在运输过程中会过度增殖、迅速将培养基消耗殆尽等原因而最终死亡，因此通常采用干冰或者液氮低温冻存的方法。低温冻存的细胞送达目的地后接着会被复苏，复苏过程需要对温度的严格控制，避免对细胞造成不可逆的损伤，但并非所有的细胞使用机构都配备常规的低温贮藏设备以及经过相关技术训练的人员。冷冻运输要求苛刻、成本高昂、细胞复苏技术要求较高。
8、在细胞的低温保存过程中，为了减少冰晶生长导致的低温损伤，经常需要在被保存的细胞悬浮液中加入特定种类和特定浓度的低温保护剂。例如，保存各类干细胞常用的低温保护剂是二甲基亚砜(dmso)，而保存人类红细胞常用的是甘油。低温保护剂的添加和去除过程常会对引起渗透性体积变化对细胞结构造成伤害，具体原因在于：添加低温保护剂过程中，胞内水会大量渗透到胞外，细胞体积显著皱缩；复温后去除低温保护剂过程中，常需要大量生理盐水稀释保护剂，在细胞内外渗透压差作用下大量水分进入细胞内，细胞体积显著膨胀。细胞体积的显著变化很容易对细胞产生不可逆转的伤害。
9、此外，常规低温保护剂，如dmso有一定的毒副作用，添加和去除保护剂过程中的离心过程也会对细胞产生一定的机械应力损伤。这一系列的损伤作用会影响细胞的功能和结构，进而影响低温保存细胞的后续使用，如干细胞结构受损会影响其分化能力，对后续细胞治疗过程产生不可估量影响。
10、第三，有的间充质干细胞难以实现现货式供应。
11、烧伤的治疗时间窗口为发生烧伤后的休克期开始，需要及时对创面进行及时的清理。而采用敷料类对创面进行处理的时间窗口同样为第一次创面处理后。而烧伤的原因为意外或急性损伤。同时，间充质干细胞发挥其治疗作用主要通过抑制局部炎症，而烧伤早期的休克期是局部炎症反应最剧烈的阶段。因此在采用间充质干细胞治疗烧伤创面修复时最佳的治疗窗口应为烧伤发生后的第一次创面清理，因此要求该细胞治疗产品应为现货式供应。
12、然而，目前间充质干细胞需要采取超低温冷冻运输至临床治疗中心，随后需要进行一系列复杂的复苏操作，随后离心、洗涤再接种，需要耗费较多的时间，这对于临床治疗中需要早期及时对创面进行处理的需求存在矛盾。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对已有的技术现状，提供一种间充质干细胞生物支架复合物的制备、冻存及复苏方法。
2、本专利技术中，将间充质干细胞制成由双层水凝胶结构构成的生物支架复合物，其网状结构能够为间充质干细胞的存活和发挥治疗作用提供三维空间；外层水凝胶层吸水性良好，且交联后强度更高，为生物支架复合物在临床应用中提供强度支撑，并确保其透水性及透气性，由此有效确保生物支架复合物稳定附着在创口上，促进烧伤创面愈合。
3、为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、第一，本专利技术提供一种间充质干细胞生物支架复合物，所述生物支架复合物包括基层水凝胶层及外层水凝胶层，所述基层水凝胶层含有间充质干细胞、人纤维蛋白原及人凝血酶，所述外层水凝胶层为经由巯基化透明质酸与聚乙二醇二丙烯酸酯交联而成。
5、第二，本专利技术提供一种间充质干细胞生物支架复合物的制备方法，包括：
6、将间充质干细胞重悬于生理盐水中，并添加冻干人纤维蛋白原，获得重悬于人纤维蛋白原溶液中的间充质干细胞悬液；
7、将所述间充质干细胞悬液与含人凝血酶的氯化钙溶液充分混合后，倒入并均匀平铺于细胞培养皿内，置于二氧化碳培养箱内孵育，直至形成基层水凝胶层；
8、将巯基化透明质酸溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯溶液混合后，倒向已形成有所述基层水凝胶层的细胞培养皿中，置于二氧化碳培养箱内孵育，直至所述基层水凝胶层上形成外层水凝胶层，得到具有双层水凝胶结构的生物支架复合物。
9、在一些实施例中，所述冻干人纤维蛋白原及所述含人凝血酶的氯化钙溶液均来源于护固莱士。
10、在一些实施例中，所述将巯基化透明质酸溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯溶液混合的步骤包括：
11、取巯基化透明质酸溶于生理盐水中，混匀后过滤灭菌，制得1.5％的巯基化透明质酸溶液；
12、取聚乙二醇二丙烯酸酯溶于生理盐水中，混匀后过滤灭菌，制得4％的聚乙二醇二丙烯酸酯溶液；
13、将所述1.5％的巯基化透明质酸溶液与所述4％的聚乙二醇二丙烯酸酯溶液混合后旋涡混合，充分混匀。
14、第三，本专利技术提供一种间充质干细胞生物支架复合物的冻存方法，包括：
15、制备上述的生物支架复合物；
16、配置玻璃化冻存缓冲液及玻璃化冻存液；
17、采用所述玻璃化冻存缓冲液充分浸润所述生物支架复合物，以提高所述生物支架复合物内的渗透压；
18、去本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种间充质干细胞生物支架复合物，其特征在于，所述生物支架复合物包括基层水凝胶层及外层水凝胶层，所述基层水凝胶层含有间充质干细胞、人纤维蛋白原及人凝血酶，所述外层水凝胶层为经由巯基化透明质酸与聚乙二醇二丙烯酸酯交联而成。
2.一种间充质干细胞生物支架复合物的制备方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞生物支架复合物的制备方法，其特征在于，所述冻干人纤维蛋白原及所述含人凝血酶的氯化钙溶液均来源于护固莱士。
4.根据权利要求2所述的间充质干细胞生物支架复合物的制备方法，其特征在于，所述将巯基化透明质酸溶液与聚乙二醇二丙烯酸酯溶液混合的步骤包括：
5.一种间充质干细胞生物支架复合物的冻存方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述玻璃化冻存缓冲液由如下按照质量体积百分数的组分组成：
7.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述玻璃化冻存液由如下按照质量体积百分数的组分组成：
8.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，还包括：
10.一种间充质干细胞生物支架复合物的复苏方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞生物支架复合物，其特征在于，所述生物支架复合物包括基层水凝胶层及外层水凝胶层，所述基层水凝胶层含有间充质干细胞、人纤维蛋白原及人凝血酶，所述外层水凝胶层为经由巯基化透明质酸与聚乙二醇二丙烯酸酯交联而成。
2.一种间充质干细胞生物支架复合物的制备方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的间充质干细胞生物支架复合物的制备方法，其特征在于，所述冻干人纤维蛋白原及所述含人凝血酶的氯化钙溶液均来源于护固莱士。
4.根据权利要求2所述的间充质干细胞生物支架复合物的制备方法，其特征在于，所述将巯基化透明质...
【专利技术属性】
技术研发人员：许峻荣，陈智聪，吴远武，武岳，冯嘉昆，蒙晓倩，魏鲁宁，王进辉，
申请(专利权)人：广东唯泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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