【技术实现步骤摘要】
本申请涉及木寡糖提取，尤其是涉及一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法。
技术介绍
1、杉叶蕨藻是一种杀手海藻，具有快速生长、耐低温和无性繁殖等特点。与陆地植物不同，杉叶蕨藻的细胞壁完全不含纤维素，而是依靠β-1,3-木聚糖来维持其机械强度。β-1,3-木寡糖（xos-3）是一种从β-1,3-木聚糖中提取的天然多糖物质，目前尚未有来自杉叶蕨藻中xos-3的生成及其潜在生物活性的信息。且少量关于xos-3的研究均是来源于价格昂贵的长茎葡萄蕨藻。相较之下，杉叶蕨藻是一种来源简易可得的生物入侵海藻，因此综合利用杉叶蕨藻及其挖掘其多糖与寡糖的显效成分具有重要意义。
2、目前，酸性水解和酶水解是获得木寡糖的主要方法，酸水解条件苛刻、仪器成本和副产物较多，其水解转化率较低。随着绿色环保理念的深入，酶促降解成为首选方法,酶解法具有高度特异性、温和的加工条件等优点。然而酶解法不稳定性与难回收的因素限制了其应用。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，以解决“然而酶解法不稳定性与难回收的因素限制了其应用”的技术问题。
2、本申请提供的一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法采用如下的技术方案：一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，包括以下步骤：
3、步骤1，将杉叶蕨藻置于超微粉碎机中粉碎，获得海藻超微粉；向超微粉中加入0.1-0.2%的naoh，90-95℃中加热
4、步骤2，向滤渣中加入1-2 %的naoh-h2o2溶液进行浸提（固液比：1:10~1:40），室温搅拌4-6小时，离心得上层浸提液；
5、步骤3，往上述步骤2的浸提液中加入3-4倍体积无水乙醇，并在4-10℃下静置沉淀过夜，离心收集沉淀；
6、步骤4，采用无水乙酸中和步骤3的沉淀，再用去离子水冲洗沉淀3-4次，去除沉淀表面残留的乙酸；
7、步骤5，真空冷冻干燥步骤4获得的沉淀，得到杉叶蕨藻多糖粉末；
8、步骤6，配置ph6.5-7.5的na2hpo4-柠檬酸缓冲液溶解杉叶蕨藻多糖粉末，溶解杉叶蕨藻多糖质量浓度为1-2%，通过液相检测溶解液中的β-1,3-木聚糖成分；
9、步骤7，纯化获得连接类弹性蛋白多肽的重组β-1,3-木聚糖酶（fe）酶液；向重组β-1,3-木聚糖酶fe酶液中添加四甲氧基硅烷，3-5min后离心收集沉淀，所得硅沉淀即为固定化后的β-1,3-木聚糖酶；
10、步骤8将上述步骤6中所得的杉叶蕨藻多糖溶液与适量固定化后的β-1,3-木聚糖酶混合后，辅助超声酶解12-15min，超声波功率为40-75 khz，速度为50-80 r/min水浴摇床中酶解20-24 h后取出，离心取上清液备用;所得上清液即为所述活性β-1,3-木寡糖；
11、所述步骤7，沉淀为固定化后的β-1,3-木聚糖酶。
12、通过采用上述技术方案，本专利技术采用来源丰富且低廉的生物入侵海藻-杉叶蕨藻，有助于拓展杉叶蕨藻的深加工途径，提升其产业价值。
13、可选的，所述步骤7中，纯化获得连接类弹性蛋白多肽的重组β-1,3-木聚糖酶（fe）酶液，其纯化步骤包括：
14、步骤a.往fe粗酶中添加nacl，使其终浓度为达到2-3mol/l；
15、步骤b.将上述步骤a中的粗酶置于35-40℃下保温15min后，离心收集沉淀；
16、步骤c.往上述步骤b中沉淀里加入冰的pbs溶液，4℃下保温1-2h离心收集上清液；
17、步骤d.上述（步骤a-步骤c）为一个循环，经过2个循环，得到较高纯度的fe蛋白。
18、通过采用上述技术方案，且此过程只需要简单的试剂氯化钠和简单的仪器-离心机即可，纯化获得连接类弹性蛋白多肽的重组β-1,3-木聚糖酶（fe）酶液更加方便快捷。
19、可选的，所述步骤7中，固定化后的β-1,3-木聚糖酶提高了固化效率；所述步骤7中，固定化后的β-1,3-木聚糖酶减小了泄漏率。
20、通过采用上述技术方案，所述步骤7中，该固定化酶嵌合体在较短的固定时间3-5min内实现96.23％的固定化效率。酶蛋白在56 h内自硅载体的泄漏率小于2％，显著提高了固化效率，降低了泄露率。
21、可选的，所述步骤8中的所得活性β-1,3-木寡糖具备良好的抗氧化效应。
22、通过采用上述技术方案，
23、可选的，所述固定化后的β-1,3-木聚糖酶具备良好的可重复使用性。
24、通过采用上述技术方案，专利技术采用易制备的固定化后的β-1,3-木聚糖酶，可重复使用12-15个循环，大大降低了酶成本。
25、综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
26、（1）目前为数不多的关于β-1,3木寡糖的提取是从价格昂贵的长茎葡萄蕨藻中所得。本专利技术采用来源丰富且低廉的生物入侵海藻-杉叶蕨藻，有助于拓展杉叶蕨藻的深加工途径，提升其产业价值。
27、（2）原有的β-1,3木聚糖的制备工艺，一般通过碱性-酸性-碱性-酸性-酸性-脱色溶液进行依次处理，步骤繁琐且需要较多的仪器设备与时间。刘倩等学者采用此工艺提取长茎葡萄蕨藻的木聚糖，其最高得率为28.1%。本专利技术稀碱-浓碱-h2o2溶液处理，不仅达到简化工艺流程的目的，而且进一步提高了β-1,3-木聚糖的得率（31.3%）。
28、（3）现有发现并验证可酶解β-1,3-木聚糖的酶只有9种，且酶解获取寡糖的方式一般采用游离酶。本专利技术采用本实验室分离且目前已报道的活性最高的β-1,3木聚糖酶与类弹性蛋白进行融合表达（fe），fe可在3-5 min介导仿生硅化生成固定化酶，固定化效率高达96.23%，在12个反应循环后仍保留了65.84％的初始活性，可大大升高酶解效率，降低酶解成本。
29、（4）现有使用的木寡糖一般是β-1,4-木寡糖，抗氧化效应较低。本专利技术采用固定化酶酶解并控制其水解程度，可实现制备的活性β-1,3木寡糖中的显效成分木二糖和木三糖的含量最优比，与β-1,4-木寡糖相比，其抗氧化活性大大提高。
30、（5）现有的酶解获取寡糖，一般采用游离酶，本专利技术采用易制备的固定化酶，可重复使用12-15个循环，大大降低了酶成本。
31、（6）本专利技术首先从杉叶蕨藻制备多糖，采用本实验室分离且目前已报道的活性最高的β-1,3木聚糖酶与类弹性蛋白进行融合表达（fe），fe可在3-5 min介导仿生硅化生成固定化酶，将固定化fe投入杉叶蕨藻多糖中进行酶解并控制其水解程度，对获得的寡糖的组成成分进行分析。发掘xos-3中的显著活性成分，为生物入侵海藻资源的深度产品开发和利用提供实验依据。
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1.一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，纯化获得连接类弹性蛋白多肽的重组β-1,3-木聚糖酶（FE）酶液，其纯化步骤包括：
3.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，固定化后的β-1,3-木聚糖酶提高了固化效率；所述步骤（7）中，固定化后的β-1,3-木聚糖酶减小了泄漏率。
4.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于，所述步骤（8）中的所得活性β-1,3-木寡糖具备良好的抗氧化效应。
5.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于，所述固定化后的β-1,3-木聚糖酶具备良好的可重复使用性。
【技术特征摘要】
1.一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，纯化获得连接类弹性蛋白多肽的重组β-1,3-木聚糖酶（fe）酶液，其纯化步骤包括：
3.根据权利要求1所述的一种固定化酶酶解制备杉叶蕨藻中β-1,3-木寡糖的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，固定化后的β-...
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