【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法和应用。
技术介绍
1、瞬时受体电位香草酸4通道蛋白(transient receptor potential cationchannel subfamily v member 4，trpv4)在骨、肺、心、血管、肾、皮肤等组织中表达，参与渗透调节、纤毛运动、骨骼发育、血管张力调节、温度感知、疼痛感知、神经元兴奋性调节和氧化应激等多种生理过程。
2、trpv4对疾病的发生和发展有重要作用，该基因突变可影响骨骼发育，引发骨科疾病，如家族性指间关节病伴短指(familial digital arthropathy-brachydactyly，fdab)等。fdab是一种常染色体显性遗传病，属于肢端畸形的一种，通常在10岁前发病，影响手指关节。成年后，指间关节、掌指关节、跖指关节可能发生畸形和疼痛性骨关节炎，但其他骨骼正常。现已明确fdab的致病基因为trpv4。
3、纤维化疾病的发生发展是一个复杂的病理过程，受多种细胞因子和信号转导的调控，其主要特征是细胞外基质的沉积增加，尤其是i型胶原和纤维连接蛋白的过度沉积。近年来，随着对纤维化病理改变研究的不断深入，发现trpv4蛋白主要参与细胞增殖、分化、凋亡、自噬等，在肝纤维化、肺纤维化、心肌纤维化、肾纤维化中发挥重要作用。
4、人体中的大型微生态系统存在于肠道。trpv4蛋白可被低渗或流体剪切激活，对温度、ph和内源性花生四烯酸敏感。研究表明，在肠系膜动脉中，当内皮细胞受到刺激时，细胞
5、鉴于trpv4基因在多种疾病中的重要作用及其作为疾病治疗的潜在靶点，因此本专利技术提供trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法和应用。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法和应用。目的是将小鼠的trpv4基因外显子8:c.1491+1g位点由碱基g突变为碱基a，使外显子拼接错误，蛋白翻译异常，得到trpv4基因编辑小鼠动物模型。
2、本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
3、第一方面，trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，包括如下步骤：利用crispr/cas9系统对小鼠trpv4基因c.1491+1g位点进行基因编辑，进而使所述小鼠的trpv4基因c.1491+1g位点由碱基g突变为碱基a，得到trpv4基因编辑小鼠动物模型；
4、所述crispr/cas9系统包括sgrna和ssodn。
5、本专利技术的原理是：本专利技术基于fdab家系的全外显子组测序和生物信息学分析，确定了基因编辑位点，并设计了crispr/cas9系统介导的小鼠基因编辑方案，成功构建了trpv4基因编辑小鼠动物模型。通过研究表明：基因编辑小鼠和野生型小鼠肾脏和肺的trpv4 mrna和蛋白表达水平显著下调；在trpv4基因编辑小鼠的尾椎骨旁发现了增生性骨；小鼠肺、肾组织的he染色结果显示肺部充血、炎症，肾小管水肿；masson染色结果显示小鼠肺、肾均发生纤维化病理改变；trpv4基因编辑小鼠与正常小鼠肠道微生物存在差异；功能预测发现肠道微生物差异菌群的功能与代谢相关。
6、本专利技术的有益效果是：本专利技术通过构建trpv4基因编辑小鼠模型，发现trpv4基因编辑对小鼠骨骼、肺和肾组织病理改变和肠道菌群有重要作用，为后续模拟人trpv4突变所致疾病机理方面以及发现人trpv4突变所致疾病药物研究方面的应用提供了研究基础。
7、在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
8、进一步，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ssodn的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9、所述sgrna的核苷酸序列：actatcagccactggagggca(5'-3')(seq id no.1)；
10、所述ssodn的核苷酸序列：cttcaccctcaccgcctactatcagccactagaaggaacgatgagtgctcactggggagccggcacaaggacagcctctg(5'-3')(seq id no.2)。
11、进一步，所述方法包括如下的具体的步骤：
12、1)将所述sgrna、ssodn和cas9蛋白混合，得到注射液；
13、2)采用显微注射的方法将所述注射液注射入小鼠受精卵的胞质中，得到注射后受精卵；
14、3)将所述注射后受精卵移植入代孕母鼠的输卵管内，发育完成后，得到f0代小鼠；
15、4)将所述f0代小鼠连续繁殖，并鉴定出trpv4基因外显子8:c.1491+1g>a基因编辑小鼠，作为trpv4基因编辑小鼠动物模型。
16、进一步，所述sgrna、所述ssodn和所述cas9的质量比为1:0.5:1。
17、进一步，步骤2)中所述小鼠受精卵的供体为c57bl/6j小鼠；所述代孕母鼠为icr小鼠。
18、进一步，所述小鼠受精卵通过小鼠促排卵和体外受精得到。
19、进一步，步骤4)中鉴定采用pcr鉴定，所述pcr鉴定的特异性引物包括上游引物和下游引物；上游引物的序列：tcttggctgcccagagta(5'-3')(seq id no.3)；所述下游引物的序列：cccaaacatctgcgtcct(5'-3')(seq id no.4)。
20、第二方面，一种用于构建trpv4基因编辑小鼠动物模型的试剂盒，所述试剂盒包括sgrna和ssodn。
21、第三方面，构建的所述的小鼠动物模型在制备模拟人trpv4突变所致疾病机理方面的应用。
22、第四方面，构建的所述的小鼠动物在制备发现人trpv4突变所致疾病药物研究方面的应用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.Trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对小鼠Trpv4基因c.1491+1G位点进行编辑，进而使所述小鼠的Trpv4基因c.1491+1G位点由碱基G突变为碱基A，得到Trpv4基因编辑小鼠动物模型；
2.根据权利要求1所述Trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述Trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下的具体的步骤：
4.根据权利要求3所述Trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述sgRNA、ssODN和Cas9质量比为1:0.5:1。
5.根据权利要求3所述Trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述小鼠受精卵的供体为C57BL/6J小鼠；所述代孕母鼠为ICR小鼠。
6.根据权利要求3所述Trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，
7.根据权利要求3所述Trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤4)中鉴定采用PCR鉴定，所述PCR鉴定的特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种用于构建如权利要求1至7任一项所述的Trpv4基因编辑小鼠动物模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括sgRNA和ssODN。
9.如权利要求1至7任一项构建的所述的小鼠动物模型在制备模拟人TRPV4突变所致疾病机理方面的药物应用。
10.如权利要求1至7任一项构建的所述的小鼠动物模型在制备发现人TRPV4突变所致疾病药物研究方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：利用crispr/cas9系统对小鼠trpv4基因c.1491+1g位点进行编辑，进而使所述小鼠的trpv4基因c.1491+1g位点由碱基g突变为碱基a，得到trpv4基因编辑小鼠动物模型；
2.根据权利要求1所述trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ssodn的核苷酸序列如seq idno.2所示。
3.根据权利要求1所述trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下的具体的步骤：
4.根据权利要求3所述trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述sgrna、ssodn和cas9质量比为1:0.5:1。
5.根据权利要求3所述trpv4基因编辑小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述小鼠受精卵的供...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。