【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和人粪菌移植，具体涉及一种粪菌冷冻保护剂及其制备方法和应用。
技术介绍
1、粪菌移植(fecal microbiota transplantation，fmt)，是将健康人粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内，重塑受体肠道菌群结构，使受体肠道微生物的组成与供体趋于一致，从而减少有害菌的数量，并逐渐恢复受体肠道微生物的正常功能，是用来治疗疾病的方法。粪菌移植(fmt)作为重建肠道菌群的有效手段，已用于难辨梭状芽孢杆菌感染等多种菌群相关性疾病的治疗和探索性研究，并被认为是近年的突破性医学进展。
2、粪菌移植的冻存方法通常为甘油冷冻保存和冷冻干燥保存，根据状态可分为新鲜、冻存和发酵三种形式。目前，使用最多的是渗透性冷冻保护剂——二甲基亚砜和甘油，保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。渗透性冷冻保护剂通常需要一定时间进行预冷以实现细胞内外的平衡，而长时间冷冻保存会显著降低活菌数，影响粪菌的保存效果。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种粪菌冷冻保护剂及其制备方法和应用，解决渗透性冷冻保护剂需要进行额外预冷的问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术的第一个方面，公开了一种粪菌冷冻保护剂，以
4、优选地，还包括5％～10％的麦芽糖。
5、优选地，还包括5％～10％的5％～10％的甜菜碱。
6、优选地，还包括0.1％～0.2％的抗坏血酸。
7、本专利技术的第二个方面，还公开了上述粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用。
8、优选地，保藏步骤为：将新鲜粪便样本与无菌生理盐水按照质量:体积＝1:5混匀，过滤，离心，洗涤，获得沉淀；将沉淀与上述粪菌冷冻保护剂按照质量比为1:2的混合，获得粪菌液。
9、优选地，混匀之前浸泡5～8min。
10、优选地，混匀的方式为：在涡旋混匀仪上涡旋5min。
11、优选地，过滤的步骤为：通过压力过滤去除固体颗粒物质，再依次经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的筛网过滤。
12、优选地，压力过滤使用的过滤介质为pp熔喷滤芯、颗粒活性炭滤芯和压缩性活性炭滤芯中的一种或多种。
13、进一步优选地，压力过滤的压力为200～250kpa。
14、优选地，离心的步骤为：以5000～6000rpm离心10～15min，弃上清液，加入无菌生理盐水重悬，以5000～6000rpm离心10～15min。
15、优选地，在≤-80℃条件下保藏，保藏时间≤6个月。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
17、本专利技术提供的一种粪菌冷冻保护剂，以海藻糖作为糖类保护剂，可以提高溶质压力，维持冻干过程中胞内外渗透压差，进而减轻菌体因失水而皱缩状态，降低冻干细胞损伤。以脱脂乳粉作为复合保护剂，其中含有丰富的蛋白质(乳清蛋白、酪蛋白)以及糖类物质，可以缩小在冷冻干燥过程中菌株暴露在氧气和介质中的面积，在冻干后形成没有特定形态的多孔结构和蛋白保护膜，有效增强菌株存货能力和发酵剂的复水能力。谷氨酸分子质量小，可以透过益生菌细胞膜进入细胞内，抑制并减缓冰晶的生成和生长，从而避免冷冻给菌株造成的损伤。甘氨酸作为渗透力很好的填充剂，能够与海藻糖、脱脂乳粉和谷氨酸协同维持胞内外渗透压差。因此，该冷冻保护剂能够促进微生物悬浮液玻璃态的形成，抑制冰晶的形成，防止形成的冰晶破坏细胞膜和蛋白质，使用前不需要预冷，能够用于粪菌移植。
18、进一步地，在海藻糖、脱脂乳粉、谷氨酸和甘氨酸的基础上，增加了麦芽糖、甜菜碱和抗坏血酸。麦芽糖和海藻糖协同作用，能够进一步提高溶质压力。甜菜碱在高渗胁迫下，能稳定角膜上皮细胞的体积，限制高渗胁迫诱导的hcle凋亡，使细胞能够在超快速的低温保存中存活，从而获得较高的细胞存活率。抗坏血酸作为抗氧化物质，其中的氢键可以与细胞膜上极性基团相连接，防止细胞膜融合，有效阻止菌体内胺基及氧化反应，进而维持冻干菌体活性，从而提高冻干存活率。
19、本专利技术提供的上述粪菌冷冻保护剂的应用，将沉淀与粪菌冷冻保护剂按照质量比为1:2混合使用，能够保证保藏效果更好，若粪菌液的浓度过高，则会会导致粪菌移植后产生腹泻、呕吐等肠道不良反应，若粪菌液的浓度过低，则会导致治疗效果不佳。使用提供的粪菌冷冻保护剂进行粪菌保藏，操作简单，便于粪菌移植。
20、进一步地，离心能够保证获得的粪菌液清澈透明，减少后期的副作用。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，以质量百分比计，包括：20％～35％的海藻糖、4％～8％的脱脂乳粉、0.1％～0.2％的谷氨酸和0.1％～0.2％的甘氨酸，余量为无菌水。
2.根据权利要求1所述的一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，还包括5％～10％的麦芽糖。
3.根据权利要求1所述的一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，还包括5％～10％的5％～10％的甜菜碱。
4.根据权利要求1所述的一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，还包括0.1％～0.2％的抗坏血酸。
5.权利要求1～4任意一项所述的粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，保藏步骤为：将新鲜粪便样本与无菌生理盐水按照质量:体积＝1:5混匀，过滤，离心，洗涤，获得沉淀；将沉淀与权利要求1～4任意一项所述的粪菌冷冻保护剂按照质量比为1:2的混合，获得粪菌液。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，过滤的步骤为：通过压力过滤去除固体颗粒物质，再依次经过直径2.0mm、1.0mm、0.5mm和0.25mm的筛网过滤。
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1.一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，以质量百分比计，包括：20％～35％的海藻糖、4％～8％的脱脂乳粉、0.1％～0.2％的谷氨酸和0.1％～0.2％的甘氨酸，余量为无菌水。
2.根据权利要求1所述的一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，还包括5％～10％的麦芽糖。
3.根据权利要求1所述的一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，还包括5％～10％的5％～10％的甜菜碱。
4.根据权利要求1所述的一种粪菌冷冻保护剂，其特征在于，还包括0.1％～0.2％的抗坏血酸。
5.权利要求1～4任意一项所述的粪菌冷冻保护剂在粪菌保藏中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，保藏步骤为：将新鲜粪便样本与无菌生理盐水按照质量:体积＝1:5混匀，过滤，离心，洗涤，...
【专利技术属性】
技术研发人员：鲁曦，张冰雁，程喜瑞，李晓璐，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：
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